高 璐， 陶曉雅， 陳峻琛， 饒勝其， 方維明， 楊振泉

(揚州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127)

?

江蘇省水產(chǎn)品中溶藻弧菌分布情況

高 璐， 陶曉雅， 陳峻琛， 饒勝其， 方維明， 楊振泉*

(揚州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127)

隨機采集江蘇省各地區(qū)的超市和農(nóng)貿(mào)市場鮮活水產(chǎn)樣品252份，參考國家標(biāo)準(zhǔn)中副溶血性弧菌的檢驗方法，采用形態(tài)特征觀察、生化特性測定并結(jié)合特異性基因測定的方法對溶藻弧菌進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果顯示，252份樣品中共有198份分離鑒定出溶藻弧菌，其分離率為79%。其中，淡水產(chǎn)品的檢出率為76%，海水產(chǎn)品的檢出率為81%。淡水魚中的溶藻弧菌檢出率低于淡水蝦貝類產(chǎn)品和海水產(chǎn)品；沿江地區(qū)的又高于沿海地區(qū)和內(nèi)陸地區(qū)，農(nóng)貿(mào)市場的高于超市。結(jié)果表明，海水產(chǎn)品與淡水產(chǎn)品中溶藻弧菌的攜帶情況非常普遍。

水產(chǎn)品；溶藻弧菌；分離鑒定

溶藻弧菌是一種革蘭陰性短桿菌，1961年由 Miyamoto、Nakamura和Takizaw發(fā)現(xiàn)，1968年Sakazaki將其命名為Vibrioalginolyticus[1]。最初被認(rèn)為是副溶血弧菌的生物Ⅱ型，研究發(fā)現(xiàn)兩者之間僅有60%～70%的基因組同源性[2]，而將其歸為1個獨立的種。溶藻弧菌過去一直被認(rèn)為不致病或僅能引起部分創(chuàng)傷性感染而未受到重視，直至1980 年才發(fā)現(xiàn)該菌與副溶血弧菌一樣可致人類腹瀉，國內(nèi)早在1985年和1989年就相繼報道過該菌引起的腹瀉和食物中毒，但目前針對溶藻弧菌的研究主要集中在其對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的危害上。近年來，江蘇省溧水縣[3]、海門市[4]、無錫市[5]、南京市[6]等多個地區(qū)也常有由溶藻性弧菌污染而引起食物中毒事件的報道。本研究采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、生化鑒定結(jié)合特異性引物PCR擴(kuò)增法對江蘇省多個地區(qū)水產(chǎn)品中的溶藻弧菌進(jìn)行分離和鑒定，旨在了解江蘇省水產(chǎn)品中溶藻弧菌的污染情況，為該菌的監(jiān)測和分子流行病學(xué)的研究提供依據(jù)，并為水產(chǎn)品的安全風(fēng)險評估提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17749，本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TCBS瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司，蛋白胨購自上海博微生物科技有限公司，PCR所用生物試劑(10×Buffer、RNase、Taq酶、dNTPs、DNA Marker)均為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 SPX-250-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博訊)；PTC-100 PCR儀(美國MJ公司)；DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)；TG16-WS型高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；GELDOCXR凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)；CO2培養(yǎng)箱(Heal Force公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采樣 2012年4月至10月，從江蘇省南京市、連云港市、揚州市等24個城市的超市及農(nóng)貿(mào)市場，按隨機采樣原則采集252份鮮活水產(chǎn)品，其中魚類108份，貝蟹類89份，蝦類61份。取整只樣品，裝入樣品袋，封口，貼標(biāo)簽，4 ℃冰箱保存，24～36 h內(nèi)送實驗室分析。

1.2.2 溶藻弧菌分離與生化鑒定 樣品處理和部分生化鑒定試驗參照GB/T 4789.7-2013《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第九版)進(jìn)行。無菌操作將樣品均質(zhì)，經(jīng)3%氯化鈉堿性鹽胨水增菌培養(yǎng)18 h后，用TCBS培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，觀察并記錄菌落顏色和形態(tài)，隨機挑取2～3個黃色圓形菌落進(jìn)行兩次純化，再對純化后的菌落進(jìn)行V-P試驗、3% NaCl三糖鐵瓊脂培養(yǎng)和嗜鹽性試驗。

1.2.3 溶藻弧菌的分子鑒定 ①基因組DNA提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)[7]或《精編分子生物學(xué)實驗指南》的CTAB法提取弧菌分離株基因組DNA。②引物設(shè)計：hsp60 基因序列是溶藻弧菌V.alginolyticus的特征基因，已在GenBank 中登記，存取號為AY332570[8]。若鑒定出有此基因序列，則可認(rèn)定菌種為溶藻弧菌。根據(jù)GenBank上hsp60 基因保守序列設(shè)計1對引物。上游引物為P1：5′-ACA ACA GCA ACG GTA CTA GC -3′；下游引物為P2：5′-CAA CTT TCA CGA TGC CAC -3′。 ③PCR擴(kuò)增：PCR 反應(yīng)體系：DNA模板，2 μL；dNTPS10 mmol/L，0.5 μL；上游引物100 pmol/μL，0.5 μL；下引物100 pmol/μL，0.5 μL；10×Buffer，5 μL；Mg2+(25 mmol/L)，3 μL；Taq酶5 U/μL，0.3 μL；ddH2O，38.2 μL。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為560 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將7 μL PCR產(chǎn)物分別和3 μL 溴酚藍(lán)混合點樣，以DNA Marker作為對照，60 V電泳1.5 h。用溴化乙錠染色20 min，在紫外凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似溶藻弧菌菌落形態(tài)

溶藻弧菌在TCBS瓊脂平板上的菌落呈圓形、凸起、光滑、濕潤、粘稠、邊緣整齊，黃色菌落、直徑2～3 mm，如圖1(A)所示。 252份樣品中共有238份在TCBS瓊脂上分離出單個黃色菌落，每份樣品挑出2～3個可疑菌落經(jīng)兩次純化后保存并進(jìn)行下一步試驗。

2.2 分離株的生化試驗

從TCBS平板上共挑出653株疑似溶藻弧菌分離株，對其進(jìn)行革蘭染色、V-P試驗、3% NaCl三糖鐵瓊脂培養(yǎng)和嗜鹽性試驗的生化鑒定。653株均為革蘭陰性菌，顯微鏡下可見菌體排列不規(guī)則、常呈短桿并略顯弧狀，如圖1(B)所示；V-P試驗中有611株呈現(xiàn)紅色，顯示V-P陽性；嗜鹽性試驗中有593株不能在0% NaCl胰蛋白胨水中生長的分離株能在3%、6%和10% NaCl胰蛋白胨水中生長；三糖鐵試驗中有558株能使三糖鐵試管斜面和底層均變?yōu)辄S色，且沒有產(chǎn)生H2S。根據(jù)生化試驗結(jié)果初步篩選出552株疑似溶藻弧菌分離株。

圖1 溶藻弧菌在TCBS上的菌落形態(tài)(A)及革蘭染色顯微成像(B)Fig.1 Colonial morphology of V.alginclyticus on TCBS agar (A) and micrograh (B)

圖2 部分溶藻弧菌分離株P(guān)CR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 PCR products of part V.alginclyticusM：marker；1：標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC1779；2～13：溶藻弧菌分離株；14：陰性對照

2.3hsp60基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

對經(jīng)生化試驗初步篩選出來的疑似溶藻弧菌分離株用溶藻弧菌特異性引物hsp60進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。部分分離株的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，552株疑似溶藻弧菌分離株共有527株分離株擴(kuò)增出560 bp大小的特異性條帶。

2.4 溶藻弧菌的檢出率

結(jié)合生化試驗和hsp60基因擴(kuò)增結(jié)果，從TCBS平板上共挑出的653株疑似溶藻弧菌分離株中有527株鑒定為溶藻弧菌，分布于198份樣品中。252份樣品中溶藻弧菌的總分離率為79%。

2.4.1 不同樣品中溶藻弧菌的檢出率 本研究的檢測樣品主要是海水和淡水中各種魚類、蝦類和貝殼類的鮮活產(chǎn)品。不同樣品中的溶藻弧菌的檢出率見表1。由表1可見，魚、蝦、貝類等不同樣品中均有溶藻弧菌的檢出，檢出率有所差異但差異不明顯。淡水產(chǎn)品中溶藻弧菌的檢出率為76%；海水產(chǎn)品中的檢出率為81%，較高于淡水產(chǎn)品。海水魚蝦貝類之間的溶藻弧菌檢出率相差無幾，在80%～82%之間；而淡水魚中溶藻弧菌的檢出率為71%，低于淡水蝦和淡水貝類產(chǎn)品。說明不同樣品中的溶藻弧菌的攜帶率稍有差異但差異不明顯。

表1 不同樣品中溶藻弧菌的檢出率

2.4.2 不同地區(qū)樣品中溶藻弧菌的檢出率 本研究所用的檢測樣品采集自江蘇省多個地區(qū)的超市和農(nóng)貿(mào)市場，根據(jù)江蘇省的地理位置特點，將樣品采集地分為沿海城市(連云港、鹽城、南通)、沿江城市(南京、揚州、鎮(zhèn)江、泰州)和內(nèi)陸城市(徐州、宿遷、淮安)。不同地區(qū)樣品中溶藻弧菌的檢出率見表2。由表2可見，沿江地區(qū)所采集樣品的檢出率為84%，稍高于沿海地區(qū)和內(nèi)陸地區(qū)，說明不同來源地樣品中溶藻弧菌的檢出率也存在一定的差異，但差異不明顯。農(nóng)貿(mào)市場所采集樣品的檢出率為84%，高于超市的71%，說明農(nóng)貿(mào)市場的交叉污染可能更為嚴(yán)重一些。

表2 不同地區(qū)中溶藻弧菌的檢出率

3 討 論

江蘇省地處我國東部沿海地區(qū)，長江、淮河下游，屬于溫帶向亞熱帶過度性氣候，雨量適中，水產(chǎn)豐富，這種特殊的地理位置和氣候特征有利于細(xì)菌的生長繁殖。本研究通過對江蘇省多個地區(qū)的水產(chǎn)品中溶藻弧菌進(jìn)行分離，并結(jié)合生化試驗和特異性引物PCR擴(kuò)增對其鑒定。結(jié)果顯示，252份樣品中共有198份分離鑒定出溶藻弧菌，其分離率為79%。其中，淡水產(chǎn)品的檢出率為76%，海水產(chǎn)品的為81%，這一結(jié)果與我們的前期研究結(jié)果基本一致[9]，而張曉艷等[10]的研究結(jié)果顯示采至上海地區(qū)海產(chǎn)品中溶藻弧菌的分離率為25.3%，這可能是因為采樣時間、樣品的種類和檢測方法的差異所致。

本研究結(jié)果顯示，不同樣品和不同采樣地的溶藻弧菌的檢出率有所差異。從樣品來看，淡水產(chǎn)品中的溶藻弧菌的攜帶率稍低于海水產(chǎn)品；而從采樣地來看，沿江地區(qū)的溶藻弧菌的攜帶率高于沿海地區(qū)和內(nèi)陸地區(qū)，這可能是由于現(xiàn)代人工養(yǎng)殖技術(shù)的普及，頻繁的交通運輸增強了水產(chǎn)品的流通性，以及農(nóng)貿(mào)市場或超市經(jīng)常將海水產(chǎn)品與淡水產(chǎn)品一起存放，導(dǎo)致各種水產(chǎn)品之間溶藻弧菌的交叉污染所致。關(guān)于淡水產(chǎn)品中溶藻弧菌的來源及其致病性，需要進(jìn)一步的溯源研究和致病性研究。

本研究結(jié)果提示，無論是淡水產(chǎn)品還是海水產(chǎn)品都存在溶藻弧菌的食物中毒風(fēng)險，因此，應(yīng)倡導(dǎo)消費者增強食品衛(wèi)生安全意識，養(yǎng)成科學(xué)健康的飲食習(xí)慣，衛(wèi)生監(jiān)督部門應(yīng)加強對餐飲業(yè)加工各環(huán)節(jié)的監(jiān)督，采取有效措施控制溶藻弧菌對水產(chǎn)品的污染。

[1] Willianms ST,Sharpe ME,Holt JG.(editors).Bergey's Manual of Systematic Bacteriology[M]，1st edn.vol.4.Baltimore:Willia ms & Wilkins,1989, 1(5): 522-538.

[2] Robert-Pillot A, Guenole A, Fournier J M. Usefulness of R72H PCR assay for differentiation betweenVibrioparahaemolyticusandVibrioalginolyticusspecies: validation by DNA-DNA hybridization[J]. FEMS Microbiol Lett, 2002, 215(1): 1-6.

[3] 趙上瑛. 一起溶藻弧菌引起的食物中毒調(diào)查報告[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué), 2001, 12(3): 28.

[4] 陳汝美. 一起溶藻弧菌引起的食物中毒報告[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué), 2002, 13(2): 42-43.

[5] 廉靖賢, 張晴, 沈梅云. 一起由溶藻性弧菌引起的食物中毒調(diào)查報告[J]. 職業(yè)與健康, 2008, 24(22): 2422-2423.

[6] 華玲慧. 一起由溶藻弧菌引起的食物中毒[J]. 安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 13 (2): 143-144.

[7] Yang Z Q, Jiao X A, Zhou X H, et al. Isolation and molecular characterization ofVibrioparahaemolyticusfrom fresh, low-temperature preserved, dried, and salted seafood products in twocoastal areas of eastern China[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 125(3):279-285.

[8] 彭喜春, 張寧, 冉艷紅, 等. 海產(chǎn)品中溶藻弧菌的篩選及其致病因子的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(4): 312-315.

[9] 高璐, 杭莉, 楊振泉, 等. 江蘇省部分地區(qū)淡水產(chǎn)品中弧菌菌群及其致病性分析[J]. 人獸共患病學(xué)報, 2013, 29(2): 142-147.

[10]張曉艷, 寧喜斌. 海水及海產(chǎn)品中溶藻弧菌的分離與鑒定[J]. 微生物學(xué)雜志, 2011, 31(3): 21-24.

Distribution ofVibrioalginolyticusin Aquatic Products in Jiangsu Province

GAO Lu, TAO Xiao-ya,CHEN Jun-chen, RAO Sheng-qi, FANG Wei-ming, YANG Zhen-quan

(Coll.ofFoodSci. &Technol.,YangzhouUni.,Yangzhou225127)

In order to investigate the distribution ofVibrioalginolyticusin fresh and live aquatic products in Jiangsu Province, 252 aquatic product samples were collected form supermarket and market for farm product in different places in Jiangsu Province. They were isolated and identified referring international detecting method forV.haemolyticusand adopting characteristic observation, biochemical characteristic determination, combined with specific gene determination. The results showed that a total of 198 samples out of 252 isolatedV.alginolyticus, account for 79%. Among them the detection rate of fresh water product was 76%, and seawater product was 81%. And the detection rate ofV.alginolyticusfrom fresh water fish was lower than fresh water shrimp and shellfish. And the carrying rate ofV.alginolyticusalong the Yangtze River was higher than coastal area and inland area; those from market for farm product higher than supermarket. The results suggested that the carrying situation ofV.alginolyticusis very common whatever the product is from fresh water or seawater.

aquatic products；Vibrioalginolyticus；isolation and identification

國家自然科學(xué)基金項目(31271945)；江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2011448)

高璐 女，講師。主要從事食品有害微生物的研究。E-mail：gaolu@yzu.edu.cn

* 通訊作者。男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事食品微生物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：yangzq@yzu.edu.cn

2014-10-25；

2014-11-17

Q938.2

A

1005-7021(2015)06-0082-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.016