吳海亞，戴元榮，應(yīng)斌宇

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.呼吸內(nèi)科）

·論 著·

羅紅霉素對(duì)離體哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

吳海亞1，戴元榮2，應(yīng)斌宇1

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.呼吸內(nèi)科）

目的：觀察羅紅霉素對(duì)離體氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）凋亡的影響以及線粒體凋亡途徑在ASMCs凋亡中的作用。方法：體外培養(yǎng)哮喘大鼠ASMCs，用不同濃度（0、10、25、50、100μg/mL分別對(duì)應(yīng)R0組、R10組、R25組、R50組、R100組）的羅紅霉素干預(yù)48 h。Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡；JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體跨膜電位（ΔΨm）的變化；Western blot法分析線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C（Cyt-c）的含量。結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組（R10組、R25組、R50組、R100組）ASMCs的早期凋亡率分別為（4.6±1.9）%、（5.8±2.9）%、12.0±5.6）%、（26.9±11.1）%，較R0組的（2.9±1.7）%高，其中R100組與R0組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=13.30，P＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)組（R10組、R25組、R50組、R100組）低ΔΨm細(xì)胞所占比例分別為（27.88±13.10）%、40.35±9.19）%、（48.40±14.15）%、（52.90±15.88）%，較R0組的（19.78±9.85）%高，其中R100組和R50組ΔΨm顯著低于R0組和R10組（P＜0.05或0.01），R25組與R0組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），R10組與R0組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組（R10組、R25組、R50組、R100組）胞漿Cyt-c的含量分別為（0.87±0.19）、（0.97±0.17）、（1.01±0.12）、（1.14±0.07），較R0組的（0.67±0.12）高，R100組與R0組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=9.075，P＜0.05）。結(jié)論：羅紅霉素可以通過(guò)激活線粒體凋亡通路促進(jìn)離體ASMCs的凋亡。

羅紅霉素；哮喘；氣道重塑；平滑肌細(xì)胞；凋亡

上世紀(jì)50年代人們就發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除抗感染作用外還有較強(qiáng)的抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)作用，其對(duì)彌漫性泛細(xì)支氣管炎（diffuse pan-bronchiolitis，DPB）具有確切的療效[1]。此后，人們開(kāi)始探索大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對(duì)其他慢性炎癥性疾?。ㄈ缦⒛倚岳w維化等）的治療作用。羅紅霉素是新一類的半合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可以降低氣道高反應(yīng)性[2]，改善哮喘患者的癥狀和肺功能[3]。Tada等[4]發(fā)現(xiàn)羅紅霉素可以抑制慢性哮喘豚鼠氣道重塑的發(fā)生。有文獻(xiàn)報(bào)道，羅紅霉素可以抑制人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖[5]，阿奇霉素可以促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）的凋亡[6-7]。本課題組早期在體實(shí)驗(yàn)顯示羅紅霉索可部分通過(guò)促進(jìn)ASMCs凋亡抑制氣道平滑肌增厚，其促進(jìn)ASMC凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)P27表達(dá)及激活線粒體凋亡通路有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)以離體哮喘大鼠ASMCs作為研究對(duì)象，觀察羅紅霉素的干預(yù)作用，并進(jìn)一步探討線粒體凋亡通路在ASMCs凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量120～140 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SM α-actin單克隆抗體（Sigma，USA）；小鼠免疫組織化學(xué)試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（HyClone，USA）；優(yōu)級(jí)胎牛血清（杭州四季青公司）；羅紅霉素（Sigma，USA）；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（Pierce，USA）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、小鼠源性α-Tubulin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（江蘇碧云天生物工程有限公司）；Annexin VFITC/PI KIT（Biovision，USA）；Agarose（Biowest，Spain）；小鼠源性細(xì)胞色素C（cytochrome c，Cytc）單克隆抗體、兔源性VDAC1/Porin多克隆抗體（Abcam，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ASMCs的體外培養(yǎng)及鑒定：SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，參照Palmans等[9]的方法復(fù)制慢性哮喘模型。模型建立后，分離大鼠支氣管樹(shù)，采用改良組織貼塊法[10]培養(yǎng)原代ASMCs，采用差速貼壁法純化細(xì)胞[11]。SM α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定平滑肌細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：取第3～第8代培養(yǎng)的細(xì)胞，隨機(jī)分為R0組（不予羅紅霉素）和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組（即R10組、R25組、R50組、R100組，羅紅霉素終濃度分別為10、25、50、100μg/mL）。用含不同濃度羅紅霉素的完全培養(yǎng)基（含10% FBS）培養(yǎng)48 h后，換無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后收集細(xì)胞檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞：收集約2×105個(gè)細(xì)胞及舊培養(yǎng)基，按照Annexin V-FITC/PI KIT說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

1.2.4 JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位（Δ Ψm）：收集2×105個(gè)細(xì)胞，按照J(rèn)C-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)胞漿內(nèi)及線粒體內(nèi)Cyt-c的蛋白水平：收集約5×107個(gè)細(xì)胞，按Pierce線粒體分離試劑盒抽提線粒體和胞漿蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。以每泳道50μg蛋白的量進(jìn)行定量分析，化學(xué)發(fā)光法顯示印跡條帶，分別測(cè)定胞漿和線粒體Cyt-c的表達(dá)。胞漿Cyt-c以α-Tubulin為內(nèi)參，線粒體Cyt-c以VDAC1/Porin為內(nèi)參。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以±s表示。正態(tài)分布資料的組間差異比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料的組間差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Nemenyi法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 離體培養(yǎng)的ASMCs的鑒定 取第3代培養(yǎng)細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，對(duì)平滑肌細(xì)胞特異的α-actin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)SP法染色，顯微鏡觀察，95%以上細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，胞漿呈棕黃色，胞核呈紫藍(lán)色（見(jiàn)圖1），證實(shí)為平滑肌細(xì)胞[11]。

2.2 細(xì)胞形態(tài)的變化情況 羅紅霉素干預(yù)48 h后，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)R100組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，絕大多數(shù)細(xì)胞收縮、變小，胞漿空泡化，顆粒物增多，部分細(xì)胞脫壁，符合凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變[6，12]；R50組和R25組可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈前述改變；R0組和R10組細(xì)胞倒置顯微鏡下觀察未見(jiàn)明顯形態(tài)改變。見(jiàn)圖2。

圖1 抗SMα-actin免疫細(xì)胞化學(xué)SP法鑒定ASMCs（×400）

2.3 細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)組（R10組、R25組、R50組、R100組）ASMCs的早期凋亡率分別為（4.6±1.9）%、（5.8±2.9）%、（12.0±5.6）%、（26.9±11.1）%，較R0組的（2.9±1.7）%高。Nemenyi法檢驗(yàn)結(jié)果顯示，R100組與R0組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=13.30，P ＜0.01）。

2.4 線粒體ΔΨm變化情況 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ΔΨm較R0組降低，且隨著藥物濃度的增加，ΔΨm降低越顯著。LSD檢驗(yàn)結(jié)果顯示R100組和R50組顯著低于R0組和R10組（P＜0.05或0.01）；R25組與R0組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而R10組與R0組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

圖2 倒置顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)（×200）

表1 各組細(xì)胞線粒體ΔΨm比較（n=4，±s）

表1 各組細(xì)胞線粒體ΔΨm比較（n=4，±s）

與R0組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與R10組比：cP＜0.05，dP＜0.01

組別 低ΔΨm細(xì)胞比率（%）R0組 19.78±9.85 R10組 27.88±13.10 R25組 40.35±9.19aR50組 48.40±14.15bcR100組 52.90±15.88bd

2.5 線粒體Cyt-c的釋放情況 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞漿內(nèi)Cyt-c的含量較R0組高，且隨藥物濃度的增高而增高，而線粒體內(nèi)Cyt-c的含量較R0組降低，且隨藥物濃度的增高，降低越顯著。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)結(jié)果為x2=11.167，P=0.025。采用Nemenyi法進(jìn)行組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)R100組與R0組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=9.075，P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3和表2。

圖3 羅紅霉素對(duì)ASMCs線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)Cyt-c的影響

3 討論

ASMCs增生和肥大直接導(dǎo)致氣道壁增厚。此外，ASMCs能合成和分泌促炎癥因子、黏附因子、趨化因子等，使氣道炎癥持續(xù)存在[13]。Johnson等[14]觀察離體培養(yǎng)的ASMCs（來(lái)自肺部手術(shù)標(biāo)本）的生物學(xué)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自哮喘患者和無(wú)氣道疾病患者的ASMCs在體外培養(yǎng)時(shí)，雖然細(xì)胞的形態(tài)相似，但前者增殖明顯快于后者，說(shuō)明離體培養(yǎng)的ASMCs保留或部分保留原有的生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)所采用的ASMCs來(lái)自慢性哮喘大鼠氣道重塑模型，旨在模擬病理狀態(tài)下的細(xì)胞生物學(xué)特性，使得研究結(jié)果更具臨床指導(dǎo)意義。

表2 胞漿和線粒體Cyt-c含量的比較（n=3，±s）

表2 胞漿和線粒體Cyt-c含量的比較（n=3，±s）

與R0組比：P＜0.05

組別 胞漿 線粒體R0組 0.67±0.12 1.01±0.03 R10組 0.87±0.19 0.97±0.01 R25組 0.97±0.17 0.92±0.08 R50組 1.01±0.12 0.78±0.13 R100組 1.14±0.07a 0.65±0.12a

磷酯酰絲氨酸（phospholipid phosphatidylserine，PS）主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，雖然細(xì)胞膜尚完整，但PS會(huì)外翻到細(xì)胞膜外側(cè)[15]，通過(guò)熒光探針標(biāo)記的Annexin V與之結(jié)合能檢測(cè)到PS的外翻[16]。而壞死或凋亡晚期細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性喪失，Annexin V能與PS結(jié)合，但同時(shí)細(xì)胞核會(huì)被碘化丙啶（PI）著色[16]。這樣可以將凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和正常活細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-FITC（+）和PI（-）細(xì)胞群所占比率（即早期凋亡率），R0組為（2.9±1.7）%，而4個(gè)實(shí)驗(yàn)組按羅紅霉素濃度從低到高分別為（4.6±1.9）%、（5.8±2.9）%、（12.0±5.6）%、（26.9±11.1）%，均高于R0組，證實(shí)了羅紅霉素能夠誘導(dǎo)ASMCs發(fā)生凋亡，且呈量效關(guān)系，與倒置顯微鏡下所見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相一致。

線粒體凋亡通路以線粒體ΔΨm下降和線粒體釋放Cyt-c入胞漿為主要特征[17]。目前認(rèn)為，線粒體釋放Cyt-c入胞漿是線粒體凋亡通路的標(biāo)志性事件[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離線粒體和胞漿蛋白，使用蛋白印跡分別對(duì)其Cyt-c的含量進(jìn)行半定量測(cè)定，結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組胞漿內(nèi)Cyt-c含量較R0組增多，而對(duì)應(yīng)的線粒體內(nèi)Cyt-c含量較R0組降低，且呈量效關(guān)系，提示羅紅霉素呈濃度依賴性地促進(jìn)線粒體釋放Cyt-c入胞漿，與吳斌等[8]的研究結(jié)果一致。線粒體ΔΨm的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前[19]。線粒體ΔΨm的下降一旦進(jìn)入不可逆過(guò)程，則引起線粒體膨脹及外膜的破裂，各種凋亡因子會(huì)通過(guò)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pole，MPTP）或破裂的外膜直接泄漏入胞漿，而致細(xì)胞凋亡發(fā)生[20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)JC-1染色檢測(cè)線粒體ΔΨm的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組低ΔΨm細(xì)胞的比率較R0組增高，而高Δ Ψm細(xì)胞的比率較R0組減少，說(shuō)明在羅紅霉素作用下，ASMCs的線粒體ΔΨm降低，與線粒體Cyt-c釋放結(jié)果一致。當(dāng)羅紅霉素濃度≥25μg/mL時(shí)，能引起線粒體ΔΨm顯著下降（P＜0.05或0.01）。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)羅紅霉素濃度達(dá)到150 μg/mL時(shí)，倒置顯微鏡下可見(jiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞脫壁、腫脹、破碎，呈現(xiàn)出壞死征象，而當(dāng)羅紅霉素濃度為100μg/mL時(shí)并未見(jiàn)明顯細(xì)胞壞死征象，提示25～100μg/mL可能為有效的藥物組織濃度。

綜上所述，羅紅霉素能激活線粒體凋亡通路，且呈濃度依賴性，從而促進(jìn)離體哮喘大鼠ASMCs發(fā)生早期凋亡。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The effect and the mechanism of Roxithromycin on apoptosis of airway smooth muscle cells from asth- matic rats in vitro

WU Haiya1,DAI Yuanrong2,YING Binyu1.1.Intensive Care Unit,the Second AffiliatedHospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027; 2.Department of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To observe the effects of Roxithromycin on apoptosis of airway smooth muscle cells ASMCs) in vitro and the role of mitochondrial pathway in apoptosis of ASMCs.Methods:ASMCs from asthmatic rats were cultured in vitro and intervened with various concentrations of Roxithromycin for 48 hours.Early apoptotic cells were detected through flow cytometry (FCM) after stained with Annexin V/PI; Alteration of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was also examined by FCM after stained with JC-1; Cytochrome C (Cyt-c) both in mitochondria and cytoplasm was analyzed by Western Blot.Results:Roxithromycin could induce the apoptotic death of ASMCs in vitro:Early apoptotic rate in experimental group (R10,R25,R50,R100) after 48 h intervention was (4.6±1.9)%,(5.8±2.9)%,(12.0±5.6)% and (26.9±11.1)%,respectively,compared to control 2.9±1.7)%.And there was a significant difference (x2=13.30,P＜0.01) between the group R100 and the control.RXM induced loss of ΔΨm:The proportion of low ΔΨm cells of the experimental group (R10,R25,R50,R100) was (27.88±13.10)%,(40.35±9.19)%,(48.40±14.15)% and (52.90±15.88)%,respectively,compared to the conrol group (19.78±9.85)%.The indexes of group R100 and R50 were significantly lower than that of group R0 and R10 (P＜0.05 or 0.01).The difference between group R25 and R0 was also statistically significance (P＜0.05).But there was no statistical difference between group R10 and R0.Roxithromycin could induce Cyt-c release rom mitochondria into the cytosol:The content of cytosolic Cyt-c in group R10,R25,R50,R100 was respecively (0.87±0.19),(0.97±0.17),(1.01±0.12),(1.14±0.07),higher than that in the control group (0.67±0.12).Therewas a significant difference between the group R100 and R0 (x2=9.075,P＜0.05).Conclusion:Roxithromycin can induce apoptosis of ASMCs in vitro via activating mitochondrial pathway.

Roxithromycin; asthma; airway remodeling; smooth muscle cells; apoptosis

R562.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.005

2014-08-07

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2080466）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009A144）。

吳海亞（1981-），女，浙江永嘉人，主治醫(yī)師，碩士。

戴元榮，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：daiyr@126.com。