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軟組織支架3D打印/壓印成形工藝研究

2015-12-27 05:45:08王振王亞寧陳冬鄭兆波劉亞雄賀健康王玲李滌塵靳忠民
關(guān)鍵詞:壓印明膠成形

王振,王亞寧,陳冬,鄭兆波,劉亞雄,賀健康,王玲,李滌塵,靳忠民

(西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,710049,西安)

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軟組織支架3D打印/壓印成形工藝研究

王振,王亞寧,陳冬,鄭兆波,劉亞雄,賀健康,王玲,李滌塵,靳忠民

(西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,710049,西安)

針對當(dāng)前采用3D打印技術(shù)制作軟組織工程支架效率低、對細(xì)胞損傷大、圓形流道成形精度低等問題,提出了壓印與打印技術(shù)相結(jié)合的直接成形新方法。首先采用壓印方法結(jié)合光交聯(lián)固化方法來制造具有流道結(jié)構(gòu)的單層軟組織支架,之后利用打印方法沿著流道注入明膠等溫敏材料,通過低溫環(huán)境使流道內(nèi)的明膠等溫敏材料固化起支撐作用,并逐層累積形成立體結(jié)構(gòu),最后利用溫度控制使流道內(nèi)的明膠融化,形成管道,最終形成具有流道結(jié)構(gòu)的軟組織支架。針對該工藝,研制開發(fā)出了相應(yīng)自動(dòng)化成形設(shè)備,結(jié)果表明,當(dāng)掃描間距為51 mm時(shí),光強(qiáng)均勻度最高,用該工藝制作出來的支架,圓弧形流道結(jié)構(gòu)清晰平滑,流道相通性很好。研究結(jié)果有利于軟組織工程支架微結(jié)構(gòu)的精確制造,可望進(jìn)一步用于細(xì)胞打印并提高細(xì)胞成活率和成形效率。

流道結(jié)構(gòu);壓印/打印成形;分層制造;軟組織工程

軟組織工程是組織工程的一個(gè)重要分支,目前在皮膚、膀胱等簡單結(jié)構(gòu)組織的再造方面取得了較大的進(jìn)展,已經(jīng)進(jìn)入臨床或臨床試驗(yàn)階段[1-2]。但是,在較大的復(fù)雜組織的再生制造方面依然困難重重,主要原因在于厚度較薄的組織可以通過營養(yǎng)物質(zhì)的滲透來為細(xì)胞提供營養(yǎng),而厚度較大的組織需要通過血管運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)給細(xì)胞。所以,模擬自然血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建帶有流道的三維支架,為細(xì)胞的生長提供所需的條件,引導(dǎo)組織器官的再生是十分重要的[3]。

文獻(xiàn)[4]利用三維打印裝置將細(xì)胞和瓊脂糖混合,制造出管徑小于3 mm的血管網(wǎng)。文獻(xiàn)[5]采用3D打印技術(shù),將肝細(xì)胞與殼聚糖明膠混合物進(jìn)行三維受控組裝,成型出具有一定三維結(jié)構(gòu)的肝組織前體。但是,這些方法都采用逐點(diǎn)掃描打印,效率低、耗時(shí)長,對細(xì)胞損傷大,成形后的支架精度低。目前有研究提出利用基于數(shù)字光處理技術(shù)技術(shù)的光固化3D打印技術(shù)來制作組織支架[6-7]。這些方法雖然能提高支架成形的效率,但仍僅限于單材料、單細(xì)胞的光交聯(lián)固化方式的成形,而且成形精度較低。壓印具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢:①具有模壓成型的特點(diǎn),效率高,特別適合重復(fù)性結(jié)構(gòu)的制造;②在制作精細(xì)結(jié)構(gòu)方面,精度較高,成形精度取決于模具的精度,特別適合具有一定圓弧度的流道成形;③壓印對材料的交聯(lián)固化方式?jīng)]有要求,可以光交聯(lián),也可以溫度交聯(lián);④壓印對生物材料的生物學(xué)性能影響很小,對打印材料中的細(xì)胞基本沒有壓力、熱源以及化學(xué)物質(zhì)等造成的損傷。為此,本文提出了3D打印與壓印相結(jié)合的工藝方法,并研制開發(fā)了相應(yīng)的自動(dòng)化成型設(shè)備。

1 成型原理與平臺(tái)構(gòu)建

1.1 壓印/打印原理

圖1所示為壓印/打印工藝流。采用兩種材料:一種是光敏性、水溶性材料,作為壓印材料,可以單獨(dú)用于制造支架,也可以復(fù)合實(shí)質(zhì)細(xì)胞后一起壓印,采用光交聯(lián)固化方法,構(gòu)建支架主體部分;另外一種是溫敏性、水溶性材料,作為支撐和犧牲材料,構(gòu)建流道,也可以復(fù)合內(nèi)皮細(xì)胞后一起打印。具體流程如下:①用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)出具有微流道的支架模型,并制作出硅膠(PDMS)模具;②向成形槽內(nèi)灌注一定量的壓印材料溶液,用上一步制作的PDMS模具壓出結(jié)構(gòu),紫外光透過模具照射壓印材料,使其固化,固化后脫模,獲得帶有流道結(jié)構(gòu)的單層支架;③沿著上一步制作出來的流道邊走邊打印犧牲材料,利用低溫環(huán)境使其固化;④重復(fù)前兩步,直到層數(shù)達(dá)到要求;⑤將獲得的三維結(jié)構(gòu)置于溫度較高的環(huán)境,使流道內(nèi)的犧牲材料融化,即可獲得帶有流通管道的三維支架。

圖1 壓印/打印集成工藝流程圖

1.2 壓印/打印裝置的組成

(a)運(yùn)動(dòng)方案設(shè)計(jì)

(b)壓印/打印平臺(tái)實(shí)物圖圖2 壓印/打印實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

針對上述工藝過程,本文開發(fā)了相應(yīng)的硬件設(shè)備,運(yùn)動(dòng)方案如圖2a所示,實(shí)物圖如圖2b所示。它主要有以下幾個(gè)部分組成:打印和壓印噴頭、40 mm×40 mm面光源、PDMS模具、干冰盒,成型槽及6軸移動(dòng)臺(tái)。在計(jì)算機(jī)程序的控制下,注射泵可實(shí)現(xiàn)打印、壓印噴頭的灌注操作。包含支架微結(jié)構(gòu)的PDMS模具置于X2、Y2二層,干冰盒用來盛放干冰,固定在X2、Y2二層。打印噴頭的管子采用聚四氟乙烯管,和自限溫伴熱帶纏繞在一起,進(jìn)行保溫,防止管道里的材料固化。成型槽(內(nèi)徑100 mm)采用聚丙烯材料,成型槽活塞桿頂部采用倒錐角結(jié)構(gòu),起到固定支架的作用。

2 工藝實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

實(shí)驗(yàn)材料:聚乙二醇雙丙烯酸酯水凝膠PEG(400)DA(上海寶曼生物科技有限公司),引發(fā)劑I-1173(2-羥基-甲基苯基丙烷-1-酮,陜西化玻器械有限公司),明膠,戊二醛,半透明硅膠等。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備:真空注塑機(jī)(陜西恒通智能機(jī)器有限公司),磁力攪拌機(jī),紫外輻照度計(jì)。

2.2 溶液的制備

(1)PEG(400)DA溶液(光敏材料)的配備[8]:量取一定體積的PEG(400)DA單體溶于去離子水中,配制體積分?jǐn)?shù)30%的PEG(400)DA單體溶液,每組加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的光引發(fā)劑I-1173,磁力攪拌10 min。

(2)明膠溶液(溫敏材料)的配置:稱取一定量的明膠粉末,用去離子水溶解,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的明膠溶液,將溶液置于40 ℃水浴中加熱至明膠粉末完全溶解。配置0.25%的戊二醛溶液,按體積比32∶1在明膠溶液中加入戊二醛溶液,攪拌30 min。

2.3 模具的制備

利用Pro/Engineer軟件,設(shè)計(jì)出具有流道結(jié)構(gòu)的支架CAD模型,并將CAD模型導(dǎo)成3D模型文件格式(標(biāo)準(zhǔn)模板庫)數(shù)據(jù)格式。利用快速成型機(jī)將CAD模型加工成樹脂支架,將樹脂支架粘在具有平整底面的容器上,有結(jié)構(gòu)的面朝上,同時(shí)將模具固定板置于支架的上方,模具固定板采用有機(jī)玻璃制作,有機(jī)玻璃板上開有適量道錐孔,用來固定PDMS模具,如圖3所示。將PDMS與固化劑以質(zhì)量100∶2的比例混合均勻,在真空條件下灌入容器內(nèi),在室溫下放置12 h使PDMS完全固化,脫模后即可獲得包含支架結(jié)構(gòu)負(fù)型的PDMS模具。

圖3 壓印模具

2.4 光強(qiáng)的均勻性優(yōu)化

2.4.1 光強(qiáng)測定 制作出來的壓印模具是由有機(jī)玻璃和PDMS組成的,各個(gè)點(diǎn)的透光率必然是不同的,因此有必要先對光強(qiáng)分布進(jìn)行測定,方法如下:采用40 mm×40 mm面光源透過壓印模具照射,光源底部距離模具頂部15 mm,在模具底部,沿著一條直線上均勻選擇15個(gè)點(diǎn),每個(gè)點(diǎn)間距10 mm,測定光強(qiáng),用Matlab進(jìn)行插值擬合,如圖4所示(圖4上的15個(gè)點(diǎn)為測量數(shù)據(jù))。

由圖4可知,光強(qiáng)中間部分較強(qiáng),兩端光強(qiáng)較弱。用該光源對內(nèi)徑較大的成型槽(如內(nèi)徑100 mm)進(jìn)行照射,光強(qiáng)會(huì)分布很不均勻。因此,對于較大面積支架成形采取光源掃描固化的方式。

(a)光強(qiáng)測定示意圖

(b)光強(qiáng)分布圖4 光強(qiáng)分布測定

2.4.2 光強(qiáng)掃描優(yōu)化 由前文得到的光強(qiáng)分布,用Matlab對相鄰兩光強(qiáng)分布進(jìn)行優(yōu)化,得到合適的光源掃描間距,如圖5所示。當(dāng)兩個(gè)波峰之間的間距為54 mm時(shí),不均勻度δ最小,為1.36%,表達(dá)式為

(1)

圖5 光強(qiáng)合成分布

2.4.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 由于壓印模具各個(gè)位置點(diǎn)的透光率不同,因此對上一步優(yōu)化的結(jié)果有必要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。掃描方法如圖6所示,掃描間距分別取48、51、54、57、60 mm,對于每一組掃描間距,在模具下方連續(xù)取7個(gè)測量點(diǎn),間距為H/6。對于每一個(gè)測量點(diǎn),光源透過模具沿著圖示掃描路徑進(jìn)行掃描照射,掃描速度為5 mm/s,每隔2 s采集一次紫外線照度計(jì)的數(shù)值,在光源掃描路徑1和2上分別采集12個(gè)時(shí)間點(diǎn),對時(shí)間積分得到各個(gè)測量點(diǎn)的曝光量,結(jié)果如圖7所示。曝光量不均勻度δe為

(2)

圖6 光源掃描測定光強(qiáng)

由圖7可知,當(dāng)掃描間距為51 mm時(shí),曝光量不均勻度為5.02%,比其他幾組掃描間距的不均勻度低,實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論值比較接近,但還是存在一些差距。壓印模具是由有機(jī)玻璃和PDMS組成,有機(jī)玻璃分布一些倒錐孔,用來固定PDMS,因此各個(gè)點(diǎn)的透光率不同,測量的結(jié)果也不會(huì)有嚴(yán)格的變化趨勢,如圖7所示的對于每個(gè)掃描間距的7個(gè)測量點(diǎn)的曝光量變化趨勢是存在差異性的。透光率的不同主要是由有機(jī)玻璃(透光率高)和PDMS(透光率低)的組合造成的,因此只需要通過改進(jìn)壓印模具的有機(jī)玻璃和PDMS的組合結(jié)構(gòu)就可以進(jìn)一步改善各個(gè)點(diǎn)的透光率。在本實(shí)驗(yàn)中,掃描間距為51 mm,曝光量不均勻度已經(jīng)滿足條件,因此掃描間距設(shè)定為51 mm。

圖7 不同掃描間距對曝光量不均勻度的影響

2.5 工藝試驗(yàn)結(jié)果

將明膠溶液和PEG(400)DA溶液分別倒入溶液槽內(nèi),將干冰切成塊狀,放入干冰盒,打開計(jì)算機(jī)軟件,設(shè)置每層溶液的添加量、冷凍時(shí)間、單層支架厚度,按照壓印/打印平臺(tái)的成型槽最大尺寸和單層最大厚度來制作支架。按照設(shè)備最大極限尺寸Φ100 mm和單層最大厚度3 mm制作的支架如圖8所示,充分顯示了壓印/打印工藝的高效率,這種大面積的支架可以用于皮膚軟組織及其支架的成形。在一般生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,僅需制作較小的支架(如Φ10 mm,高度10 mm的支架)。

從圖8可以看出,用打印/壓印技術(shù)制作出來的的支架流道結(jié)構(gòu)清晰可見,圓弧狀流道比較平滑,充分體現(xiàn)了壓印在制作精細(xì)流道結(jié)構(gòu)方面的優(yōu)勢,而且層與層之間的連接比較緊密,形狀保持良好。以上結(jié)果表明,用該方法制作立體微流道支架是完全可行的。

3 討 論

軟組織體積較大,血管是軟組織的重要組成部分。如何模擬自然器官血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建三維流道支架是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。支架內(nèi)部的流道為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì),運(yùn)走新陳代謝產(chǎn)物,對支架的生物性能有關(guān)鍵影響[9-11]。本文提出的壓印/打印技術(shù)具有以下優(yōu)勢。

(1)本工藝成形效率高。傳統(tǒng)組織工程主要依賴于手工操作,造成支架的成形效率低、結(jié)構(gòu)保持性以及重復(fù)性差。組織工程支架多具有重復(fù)性結(jié)構(gòu),而目前基于點(diǎn)掃描方式的3D打印技術(shù)多采用逐點(diǎn)掃描、逐點(diǎn)固化的方式,效率較低,耗時(shí)長,不利于細(xì)胞的存活。壓印具有模壓成型的特點(diǎn),在制造重復(fù)性結(jié)構(gòu)上效率高,而且不改變材料的性能,對細(xì)胞的損傷小。

(a)三維支架

(b)剖切外圓周的三維支架

(c)支架局部流道放大圖圖8 用打印/壓印技術(shù)制作的支架

(2)本工藝對材料沒有特殊的要求,可以實(shí)現(xiàn)材料的多種交聯(lián)固化方式,并且可以復(fù)合細(xì)胞進(jìn)行多材料、多細(xì)胞的打印成形?;贒LP技術(shù)的光固化3D打印技術(shù),雖然成形效率較高,但是目前無法實(shí)現(xiàn)多材料、多細(xì)胞的精確分布和個(gè)性化成形,材料的固化方式僅限于光交聯(lián)固化方法。本文實(shí)驗(yàn)選擇兩種生物材料,一種是光敏材料,可以復(fù)合肝細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞,作為支架的主體;一種是溫敏材料,作為犧牲材料,可以復(fù)合內(nèi)皮細(xì)胞,用來構(gòu)建流道,起到支撐下一層結(jié)構(gòu)的作用,在支架完成之后,通過溫控方法使其融化,形成流道,此時(shí)會(huì)有部分內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長,有利于血管的形成。本文提出的壓印/打印成形方法,還可適用于兩種溫敏材料的成型,如膠原與明膠,膠原在pH值為7.0、溫度高于0 ℃會(huì)自發(fā)成膠,因此可以把膠原作為壓印材料,復(fù)合肝細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞,把明膠作為犧牲材料,復(fù)合內(nèi)皮細(xì)胞來制作軟組織支架。通過改造設(shè)備,增加噴頭數(shù)量,還可實(shí)現(xiàn)多種壓印材料和多種犧牲材料的一體化成形,制造出的軟組織支架的每層結(jié)構(gòu)的材料都不一樣。

(3)支架流道結(jié)構(gòu)取決于模具,如果模具的結(jié)構(gòu)越小,理論上制作出來的支架流道也就越小。且壓印可以制作出半圓形的流道,流道表面的平滑程度取決于模具表面的平滑程度,流道越平滑越有利于內(nèi)皮細(xì)胞的爬壁生長。如果是具有多種形狀結(jié)構(gòu)的模具,可以制作出每一層結(jié)構(gòu)都不一樣的支架,流道網(wǎng)絡(luò)也就很豐富。

(4)該工藝有望進(jìn)一步拓展模具材料的可選擇范圍。文獻(xiàn)[12]提出使用冰制模具來制造多孔肝組織支架,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,引入冰制模具實(shí)現(xiàn)了微流道結(jié)構(gòu)和與外界空間完全連通的多孔結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞初始接種率和后期培養(yǎng)中細(xì)胞的活性表達(dá)。速凍液的快速發(fā)展降低了細(xì)胞材料一體化低溫成形的難度,因此模具可以嘗試用冰模代替PDMS,壓印材料用溫度交聯(lián)固化方法,如水凝膠、肝細(xì)胞和速凍液混合,利用超低溫冰模制作軟組織支架。

本文實(shí)驗(yàn)中使用了光交聯(lián)固化方式,紫外光對細(xì)胞是有損傷的,不同類型的細(xì)胞對紫外光的耐受力不同,本文采用的模具是由PDMS和有機(jī)玻璃組成,需要進(jìn)一步改進(jìn)模具的組合構(gòu)造,來提高模具各個(gè)點(diǎn)的透光均勻性,以此減少紫外光對支架和細(xì)胞成形的損傷。

雖然采用本文搭建的3D打印/壓印實(shí)驗(yàn)平臺(tái)能夠制作出三維微流道支架,但還是有很多工藝需要進(jìn)一步深入研究。例如:如何進(jìn)一步提高壓印精度;明膠融化后對支架層間連接強(qiáng)度的影響;本文提出的工藝在后期需要復(fù)合細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),觀察細(xì)胞的生長情況,針對不同的細(xì)胞,改變壓印模具來改善各個(gè)點(diǎn)的透光均勻性,并且通過實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制好紫外光曝光量和曝光時(shí)間,使軟組織支架在成型行過程中,細(xì)胞具有較高的存活率;為進(jìn)一步提高細(xì)胞存活率,后期還可以通過更換可見光光源以及光敏材料來實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié) 論

(1)針對采用3D打印技術(shù)成形軟組織支架效率低、對細(xì)胞損傷大、圓形流道成型精度低等難題,本文提出了壓印/打印集成技術(shù)工藝方法。研制開發(fā)了相應(yīng)的自動(dòng)化成形平臺(tái),進(jìn)行了光強(qiáng)均勻性優(yōu)化的工藝分析,得到掃描間距為51 mm時(shí)光強(qiáng)均勻度最高的結(jié)果。

(2)采用該工藝方法制作出來的軟組織支架,層與層之間連接緊密,流道結(jié)構(gòu)清晰平滑,且形狀保持良好。研究結(jié)果表明,這種方法制作立體微流道支架是完全可行的,制作效率較高,并且有希望用于細(xì)胞打印研究。

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(編輯 杜秀杰)

3D Printing/Imprinting Molding Process of Soft Tissue Scaffolds

WANG Zhen,WANG Yaning,CHEN Dong,ZHENG Zhaobo,LIU Yaxiong,HE Jiankang,WANG Ling,LI Dichen,JIN Zhongmin

(State Key Laboratory for Manufacturing Systems Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

Focusing on the low efficiency, lager cell damage and low forming accuracy of circular channel in soft tissue scaffolds construction by 3D printing technology, a novel method is presented to fabricate scaffolds by combining imprinting with 3D printing techniques. The imprinting technique is combined with light crosslinking method to make single-layer soft tissue scaffold with flow channel structure. Then, gelatin, a kind of temperature-sensitive material, is injected along the flow channel by printing technique to cure in the low temperature environment to support the upper layers. A stereoscopic structure is formed via the layer-by-layer accumulation. The gelatin is finally melted in the flow channel by temperature control to form pipelines. An automatic fabrication device is developed to realize the strategy. The results demonstrate that the light uniformity reaches the maximum when the scanning interval reaches 51 mm, and that the arc-type flow channel structure is clearly visible and interlinked. The approach is beneficial to accurate manufacture of soft tissue scaffolds, and it can be expected to improve cell survival rate and forming efficiency in cell printing.

channel structure; imprinting/printing; layer-by-layer fabrication; soft tissue engineering

2015-01-31。 作者簡介:王振(1990—),男,碩士生;劉亞雄(通信作者),男,教授,博士生導(dǎo)師。 基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51275387);中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目。

時(shí)間:2015-06-29

10.7652/xjtuxb201508023

Q811.2

A

0253-987X(2015)08-0141-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http:∥www.cnki.net/kcms/detail/61.1069.T.20150629.1137.005.html

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