王潤東，邵 偉

（1.湖北智慧果林業(yè)科技有限公司技術(shù)中心，湖北興山443700；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443001）

紅茶菌固定化發(fā)酵葛根茶飲料工藝研究

王潤東1，邵 偉2*

（1.湖北智慧果林業(yè)科技有限公司技術(shù)中心，湖北興山443700；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌443001）

以葛根纖維提取物為原料進行紅茶菌發(fā)酵，并以發(fā)酵茶中的總酸含量、總糖利用率和對發(fā)酵液的感官評價分作為評價指標，探討了蔗糖添加量、接種量、揺瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間等因素對固定化細胞技術(shù)發(fā)酵葛根茶飲料的影響，并通過正交試驗優(yōu)化了發(fā)酵葛根茶飲料的最佳工藝條件。結(jié)果表明，蔗糖添加量為70 g/L，接種量為8%，揺瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵時間為7 d，所制得的發(fā)酵葛根茶飲料色澤均勻，酸甜可口。

葛根；紅茶菌；固定化；發(fā)酵；飲料

葛根（Pueraria lobota）為藤本植物葛的塊根，莖被稀疏的棕色長硬毛，是我國南方一些省區(qū)的一種藥食兩用植物，其味甘涼可口，常作煲湯之用。其主要成分是淀粉，此外還含有約12%的黃酮類化合物，包括大豆（黃豆）甙、大豆甙元、葛根素等10余種；并含有胡蘿卜甙、氨基酸、香豆素類等[1-5]。葛根在提取完淀粉后，其葛根纖維渣多半丟棄，造成環(huán)境的污染，而其中也含有大量的有益成分，若能加以利用則有益于葛根產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

近年來，紅茶菌飲料在世界各國都頗受歡迎，它主要由醋酸菌、乳酸菌等多種微生物共同對糖茶水進行發(fā)酵而成[6-10]。目前，紅茶菌大都是采用靜置培養(yǎng)的方式，這種方式易受雜菌污染，培養(yǎng)條件要求較高，菌種不宜保藏等。固定化技術(shù)是將酶或細胞固定于一定范圍內(nèi)，使它們既保持原有的活性，又可以在連續(xù)反應(yīng)后回收并實現(xiàn)重復(fù)利用的一項技術(shù)[11]。同游離細胞相比，細胞經(jīng)固定化后在單位體積內(nèi)細胞濃度大幅度增加，提高發(fā)酵速率；其次，固定化細胞發(fā)酵性能穩(wěn)定；再者，細胞固定后可以重復(fù)利用，對于生產(chǎn)胞外產(chǎn)品的發(fā)酵簡化了細胞分離的步驟，節(jié)約了發(fā)酵過程的生產(chǎn)成本[12]。

本研究將葛根纖維渣中的有益成分進行抽提，以固定化細胞技術(shù)發(fā)酵葛根茶飲料，不僅可解決游離菌混合靜置發(fā)酵生產(chǎn)紅茶菌時存在的弊端，而且這種發(fā)酵方式有助于控制產(chǎn)品的質(zhì)量，對葛根發(fā)酵茶飲料的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義，從而為發(fā)酵葛根茶飲料的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根纖維渣：湖北智慧果林業(yè)科技發(fā)展有限公司；紅茶菌：由三峽大學(xué)微生物實驗室提供并保藏；白砂糖：市售。

海藻酸鈉、明膠均為化學(xué)純，其他試劑均為分析純：國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

紅茶菌活化培養(yǎng)基的制備：蔗糖10 g，酵母膏10 g，碳酸鈣15 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 m L，pH 6.8，121℃滅菌20 min，培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入5%的無水乙醇。

發(fā)酵葛根茶飲料培養(yǎng)基的制備：將30g葛根纖維渣加入到1000m L沸水中，浸提60min，再將一定量的蔗糖（70g/L）加入到茶液中，混勻溶解，200目濾網(wǎng)過濾，得濾液，加水補足1 000m L，分裝至三角瓶中，裝液量為120 m L/250 m L，巴氏消毒（85℃、10 min），冷至室溫備用。

1.2 儀器與設(shè)備

ALC-210.4型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BXM-30R全自動立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫(yī)療器械有限公司；L550低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；ZD85-1振蕩培養(yǎng)器：蘇州國華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵葛根茶飲料加工工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）固定化紅茶菌細胞的制備[13]

將5.5%的海藻酸鈉和1.5%的明膠充分溶解，滅菌后待其溫度降至室溫時，將培養(yǎng)好的紅茶菌懸液與等體積的固定化載體溶液充分混勻，混勻后的紅茶菌混合液用注射器滴入0.6%的氯化鈣溶液中，得到固定化紅茶菌細胞顆粒，固定1 h后用無菌水沖洗，重新加入0.6%的氯化鈣溶液，4℃平衡過夜，備用。

（2）發(fā)酵葛根茶飲料的制備

按8%接種量向裝液量為120 m L/250 m L的發(fā)酵葛根茶飲料培養(yǎng)基中接入固定化紅茶菌細胞顆粒，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，發(fā)酵結(jié)束后，用200目濾網(wǎng)過濾發(fā)酵液，濾液裝瓶后進行巴氏消毒（85℃、10 min），冷卻后即為成品。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

以總酸含量、總糖利用率及感官評分為考察指標，分別考察蔗糖添加量（50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/L、100 g/L），接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%），搖瓶轉(zhuǎn)速（100 r/m in、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/m in、200 r/m in、220 r/m in），發(fā)酵時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）等因素對發(fā)酵葛根茶飲料品質(zhì)的影響。

1.3.4 固定化發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗，選擇蔗糖添加量（A）、接種量（B）、揺瓶轉(zhuǎn)速（C）和發(fā)酵時間（D）等4個因素，每個因素選取3個水平，以感官評分為評價指標，按L9（34）正交表設(shè)計試驗，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.5 測定方法

在葛根茶飲料發(fā)酵過程中，每隔一天分別測定發(fā)酵液的總酸含量、總糖利用率，并對成品進行感官評價，以此分析各因素對葛根茶發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響。

（1）總酸的測定

采用國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法。

（2）總糖利用率的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖含量[14]?？偺抢寐视嬎愎饺缦拢?/p>

（3）發(fā)酵葛根茶飲料感官評價[15]

組織10人為感官評價小組，根據(jù)表2的評價標準，對不同產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味進行鑒定并打分，滿分為4分，以感官評分平均值作為最終的感官評價結(jié)果。

表2 發(fā)酵葛根茶飲料感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermentation kudzu root beverage

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖添加量對發(fā)酵葛根茶飲料的影響

由圖1可知，隨著蔗糖添加量的增加，發(fā)酵液的總糖利用率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當蔗糖添加量為80 g/L時，發(fā)酵液的總糖利用率最大，而隨著蔗糖添加量的增加，發(fā)酵液中的總酸含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢，由此可見蔗糖添加量越大，對紅茶菌的抑制作用越強，總酸含量越低。因此，初步確定發(fā)酵葛根茶飲料培養(yǎng)基中蔗糖添加量為60～90 g/L。

圖1 蔗糖添加量對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.1 Effect of sucrose addition on total acid content and total sugar utilization

表3 蔗糖添加量對感官評分的影響Table 3 Effect of sucrose addition on sensory evaluation score

由表3可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這是因為蔗糖添加量過低或過高，會導(dǎo)致發(fā)酵液偏酸或偏甜，而當蔗糖添加量為70～80 g/L時，發(fā)酵液酸甜可口，感官評價分值最高。

2.2 接種量對發(fā)酵葛根茶飲料的影響

圖2 接種量對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.2 Effect of inoculum on total acid content and total sugar utilization

由圖2可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷增加，但接種量在10%～15%時發(fā)酵液的總酸含量差別不大，這是由于接種量過大時，醋酸菌會大量消耗發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)用于其自身的生長、繁殖，并代謝大量的廢物。同時，接種量＞10%時，發(fā)酵液中總酸含量過大，影響發(fā)酵液品質(zhì)，而接種量為2.5%時，發(fā)酵不徹底，發(fā)酵液的總酸含量僅為5.43 g/L，這說明接種量過高或過低，都不利于葛根茶飲料的發(fā)酵。因此，初步確定接種量為6%～10%。

表4 接種量對感官評分的影響Table 4 Effect of inoculum on sensory evaluation score

由表4可知，隨著接種量的增加，感官評價分值呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當接種量為8%時，感官評分最高，這說明8%的接種量有益于發(fā)酵葛根茶飲料的品質(zhì)。

圖3 搖瓶轉(zhuǎn)速對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.3 Effect of shaking speed on total acid content and total sugar utilization

2.3 搖瓶轉(zhuǎn)速對發(fā)酵葛根茶飲料的影響

由圖3可見，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液的總酸含量和總糖利用率均不斷提高，這是由于轉(zhuǎn)速的提高有利于氧在發(fā)酵液中的溶解，使發(fā)酵液中的糖分更易于轉(zhuǎn)化為醋酸，但轉(zhuǎn)速達到200 r/min后，其對溶氧的貢獻達到了極限，出現(xiàn)了發(fā)酵液中總酸含量和總糖利用率增加緩慢的現(xiàn)象，這說明一定的搖瓶轉(zhuǎn)速對葛根茶飲料的發(fā)酵是有益的。因此，初步確定搖瓶轉(zhuǎn)速為140～200 r/min。

表5 搖瓶轉(zhuǎn)速對感官評分的影響Table 5 Effect of shaking speed on sensory evaluation score

由表5可知，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，感官評價分值呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min時，感官評價分最高，這說明采用180 r/min的搖瓶轉(zhuǎn)速制得的發(fā)酵葛根茶飲料品質(zhì)較好。

2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵葛根茶飲料的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵進行，發(fā)酵液中總酸含量和總糖利用率隨發(fā)酵時間的延長均呈同步增長趨勢，這是因為發(fā)酵葛根茶飲料中的紅茶菌生長繁殖不僅需要消耗糖類物質(zhì)，而且乙酸、乙醇等產(chǎn)物的生成也需要通過糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。到發(fā)酵的第7天時，發(fā)酵液中總酸含量為14.2g/L。因此，初步確定搖瓶發(fā)酵時間為6～8 d。

圖4 發(fā)酵時間對總酸含量和總糖利用率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total acid content and total sugar utilization

表6 發(fā)酵時間對感官評分的影響Tab le 6 Effect of fermentation time on sensory evaluation score

由表6可知，發(fā)酵時間過短或過長時，感官評分偏低，發(fā)酵液品質(zhì)不佳，當發(fā)酵時間為7 d時，感官評價分值最高，發(fā)酵液品質(zhì)較好。

2.5 葛根茶飲料發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表7。

表7 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

從表7可知，所選的4個因素對葛根茶飲料發(fā)酵的影響依次為發(fā)酵時間＞接種量＞搖瓶轉(zhuǎn)速＞蔗糖添加量。通過極差分析可知，最佳工藝條件為A1B2C3D2，即蔗糖添加量為70 g/L，接種量為8%，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時間為7 d。在此條件下進行驗證試驗，發(fā)酵葛根茶飲料的感官評分為3.5分，產(chǎn)品色澤均勻，酸甜可口，具有葛根發(fā)酵茶發(fā)酵液特有的風(fēng)味。

3 結(jié)論

以葛根纖維提取物為原料，利用固定化細胞技術(shù)實現(xiàn)了葛根茶飲料的固定化發(fā)酵，結(jié)果表明，通過單因素和正交試驗得出固定化發(fā)酵葛根茶飲料的最佳工藝條件為蔗糖添加量70 g/L，接種量8%，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/m in，發(fā)酵時間為7 d。在此條件制備的發(fā)酵葛根茶飲料色澤均勻，酸甜可口。

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Preparation process of kudzu root beverage by immobilized kombucha fermentation

WANG Rundong1,SHAO Wei2*
(1.Technology Center of Hubei Wisdom Fruit Forestry Science and Technology Co.,Ltd.,Xingshan 443700,China; 2.College of Biological and Pharmaceutical Sciences,China Three Gorges University,Yichang 443001,China)

Using kudzu root fibers extract as raw materials to conduct fermentation,and the total acid content,total sugar utilization and sensory evaluation on fermentation liquor as evaluation index,the effects of sucrose concentration,inoculum,shaken bottle speed and fermentation time on kudzu root beverage by immobilized cell fermentation was discussed.The processing conditions of kudzu root beverage were optimized by orthogonal experiment as follows:sucrose concentration 70 g/L,inoculum 8%,shaken bottle speed 180 r/min,and fermentation time 7 d.The product had uniform color and distinctive flavor.

kudzu root;kombucha;immobilization;fermentation;beverage

TS261.7

A

0254-5071（2015）03-0158-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.038

2015-02-09

三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院2013年資助項目（2014HY 005）

王潤東（1987-），男，助理工程師，本科，主要從事食品開發(fā)與研究工作。

*通訊作者：邵偉（1966-），男，高級實驗師，碩士，主要從事微生物學(xué)教學(xué)及研究工作。