董 丹，蔣 麗，關(guān)統(tǒng)偉，車振明，曾 雷

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039）

豆瓣中產(chǎn)磷脂酶菌株的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析

董 丹，蔣 麗，關(guān)統(tǒng)偉，車振明*，曾 雷

（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610039）

以一級郫縣豆瓣為原料篩選磷脂酶高產(chǎn)菌株，通過磷脂平板初篩和搖瓶復(fù)篩法，以磷脂酶水解圈作為篩選模型，并對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行了酶活力的檢測及細(xì)菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，從一級豆瓣中篩選出10株產(chǎn)磷脂酶菌株，其中產(chǎn)酶活力最高的為編號LZ8，酶活力為68.32 U/m L，經(jīng)鑒定該菌株為Bacillus sonorensis，屬于芽孢桿菌屬，其與最高同源性菌株相似性為100%。

磷脂酶；系統(tǒng)發(fā)育分析；酶活力；芽孢桿菌屬

磷脂酶（phospholipase，PL）是生物體內(nèi)負(fù)責(zé)磷脂的代謝和生物合成的一類酶，能催化甘油磷脂的各種水解反應(yīng)，根據(jù)磷脂酶水解磷脂位置的不同可分為5類：磷脂酶A1、A2、B、C、D，按其生物功能可歸納為3類：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的維護(hù)和修復(fù)；細(xì)胞內(nèi)代謝機(jī)制和信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)；體內(nèi)磷脂的消化[1]。磷脂酶不僅在生物體內(nèi)具有很重要的生理功能，而且廣泛應(yīng)用于油脂精煉、磷脂改性、飼料添加劑和醫(yī)藥等方面[2]。最初的磷脂酶A1、A2和磷脂酶D等均是從蛇毒、動(dòng)物的胰臟中提取，來源有限[3]，滿足不了市場需要。微生物種類繁多，生長周期短，易于分離和誘變，可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)，因此微生物磷脂酶的研究發(fā)現(xiàn)為其應(yīng)用提供了方便的來源。迄今已有十多種產(chǎn)磷脂酶A的細(xì)菌得到了廣泛的研究[4-6]。特別是微生物來源的磷脂酶A可以采用發(fā)酵的方法大規(guī)模生產(chǎn)后，對磷脂酶A1應(yīng)用于植物油脫膠的研究也越來越深入[7-9]。目前，油脂加工業(yè)中采用酸煉脫膠、超級脫膠等連續(xù)式國窖工藝可將油脂中含磷量脫除到15 mg/kg以下[10]，而食用油中的磷脂殘留在5 mg/kg以下最理想[11]，酶法已經(jīng)越來越受到關(guān)注。因此獲得高酶活的磷脂酶產(chǎn)生菌有著廣闊的應(yīng)用前景。然而，國內(nèi)尚無商業(yè)化磷脂酶的生產(chǎn)，目前所使用的磷脂酶多來自進(jìn)口[12]。本實(shí)驗(yàn)從郫縣豆瓣樣品中篩選磷脂酶高產(chǎn)菌株，這對于研究磷脂酶對豆瓣風(fēng)味物質(zhì)的形成所起的作用，以及未來以此改善豆瓣品質(zhì)，完善豆瓣生產(chǎn)工藝，有著十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

一級郫縣豆瓣：四川郫縣恒豐和食品有限公司，樣品取回置于4℃冰箱保存，備用。

1.1.2 試劑

核酸染料（Goldview）、三羧甲基氨基甲烷（Tris堿）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、TE緩沖溶液（Tris-EDTA buffer）：上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、甘油、無水乙醇、異戊醇、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、大豆磷脂、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：成都市科龍劑化工廠；Ex Taq DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：大連Takara公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒（離心柱）：捷瑞生物工程（上海）有限公司；LecitaseRUltra：Novozyme公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母膏0.2 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鈉3.5 g，磷酸二氫鉀1.5 g，硫酸鎂0.05 g，橄欖油5 m L，調(diào)節(jié)pH至7.0，用蒸餾水定容至1 000 m L，121℃滅菌20 m in。

磷脂篩選培養(yǎng)基：大豆磷脂10 g，磷酸氫二鉀1.0 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂15.0 g，調(diào)節(jié)pH到達(dá)7.0，用蒸餾水定容至1 000 m L，121℃滅菌20 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖0.5 g，蛋白胨2 g，磷酸氫二鉀0.2 g，磷酸二氫鉀1 g，大豆磷脂1.0 g，調(diào)節(jié)pH至7.0，用蒸餾水定容至100 m L，121℃滅菌20 m in。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TB-214型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)：方舟科技有限公司；9700型PCR擴(kuò)增儀；美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 平板初篩

取采集到的一級郫縣豆瓣樣品10 g，用100 m L生理鹽水稀釋10倍，漩渦振蕩混勻，取混合后的懸液5 m L加至50 m L富集培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，2 d后取1 m L菌液用無菌水稀釋，稀釋梯度為10-1、10-2、10-3，取3個(gè)梯度的菌懸液分別涂布于以大豆磷脂為單一碳源的篩選平板上，置于37℃和28℃培養(yǎng)48 h，形成單菌落，挑選出透明圈明顯的菌落，測定其水解圈半徑大小，斜面編號保存。

1.3.2 搖瓶復(fù)篩

挑取能在初篩培養(yǎng)基上生長并能產(chǎn)生水解圈的菌落進(jìn)行純化分離，純化后再接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待長出菌落，以1%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)3 d后，發(fā)酵液在4℃條件下10 000 r/m in離心10 m in，取上清液作為粗酶液，通過測定磷脂酶活力，篩選出產(chǎn)磷脂酶能力較強(qiáng)的菌株。

1.3.3 磷脂酶活力的測定

磷脂酶活力的測定采用氫氧化鈉滴定法[13]，略有改動(dòng)。酶活力定義為：在30℃和pH值為7.0條件下，每分鐘水解磷脂產(chǎn)生1 μmoL游離脂肪酸所需要的酶量即為1個(gè)磷脂酶活力單位（U）。LecitaseRUltra為液體酶制劑，其磷脂酶活力表示為每1 m L酶液所得的磷脂酶活力單位，即U/m L。

式中：X為樣品的酶活力，U/m L；V為滴定樣品時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0為滴定空白時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，m L；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量，mol/L；50為0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；n為酶液樣品的稀釋倍數(shù)；t為測定酶活時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，m in。

操作步驟如下：一定量的底物無油磷脂、0.5%PVA溶于預(yù)定pH值的緩沖液中，用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min的條件下均質(zhì)3 min，得到底物溶液。取4個(gè)100 m L高型燒杯，2個(gè)作為空白瓶，2個(gè)作為樣品瓶，各加底物溶液25 m L，再于空白瓶中加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇15 m L，于預(yù)定溫度的水浴中預(yù)熱5 m in，然后在各瓶中加入LecitaseRUltra酶液預(yù)定稀釋倍數(shù)的稀釋液1 m L（用緩沖液稀釋），立即混勻計(jì)時(shí)，在預(yù)定溫度的水浴中180 r/min的條件下振蕩反應(yīng)一定時(shí)間，于樣品瓶中立即補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇15 m L終止反應(yīng)，取出，于自動(dòng)滴定儀下用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)堿液平均消耗量。

NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05mol/L）的配制：按GB601《化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》配制和標(biāo)定c（NaOH）=0.5 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)，準(zhǔn)確稀釋10倍。

緩沖液的配制：0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液與0.1 mol/L檸檬酸溶液按不同比例配制，并在酶活測定的溫度下進(jìn)行微調(diào)以獲得所需pH值的緩沖液。

大豆?jié)饪s磷脂的處理：為獲得無油的大豆?jié)饪s磷脂，將購得的大豆磷脂進(jìn)行3次以上的丙酮脫油處理，真空脫溶后獲得無油大豆磷脂。

1.3.4 16S rRNA鑒定

菌株液體培養(yǎng)12h，DNA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）[14-15]法。得到的樣品總DNA于-20℃保存。以提取得到的DNA為模板，細(xì)菌選擇通用引物Eμ27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)條件：95℃、4 min；95℃、60 s，56℃、60 s，72℃、120 s，35個(gè)循環(huán)；72℃、10 min。真菌選擇引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反應(yīng)條件：95℃、4 m in；94℃、30 s，53℃、30 s，72℃、40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃、7 min。PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 37.5 μL、DNA模板1 μL。PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時(shí)間40 min。純化過程按照DNA膠回收試劑盒中的步驟進(jìn)行，具體步驟參照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit試劑盒說明。PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果提交美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of bioteehnology information，NCBI）（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

以大豆磷脂為唯一碳源進(jìn)行產(chǎn)磷脂酶微生物的篩選，篩選平板上的水解圈大小與磷脂酶活力呈正相關(guān)，經(jīng)初步篩選從一級豆瓣樣品中分離得到10株磷脂酶生產(chǎn)菌株，測量其水解圈直徑與菌落直徑的比值（R），結(jié)果見表1。

表1 初篩菌株透明圈直徑與菌株直徑的比值Table 1 Ratios of transparent circle diameters to colony diameters of new ly screened strains

由表1可知，從一級豆瓣中分離得到10株磷脂酶產(chǎn)生菌株，其中有3株R值＜1.5，3株介于1.5～2.0，而R值＞2.0的有4株，分別為LZ1、LZ2、LZ8、LZ9。將這4株菌株進(jìn)一步采用搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，比較各菌株的產(chǎn)酶能力。

2.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

將初篩的到的4株產(chǎn)磷脂酶活力較高菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，經(jīng)過4輪復(fù)篩過后，檢測其酶活力的大小，檢測結(jié)果如表2所示。

表2 菌株復(fù)篩酶活力情況Table 2 Strain rescreening results of enzyme activity

由表2可以看出，比較4株磷脂酶產(chǎn)生菌，菌株LZ8酶活力最高，為68.32U/m L。因此LZ8可作為后續(xù)研究使用菌株。

2.3 生理生化檢測

菌株LZ8在平板上生長良好，表面光滑、略微凸起、淡黃色、呈黏稠狀，顯微鏡下觀察呈桿狀。生理生化特性如表3所示。

表3 菌株LZ8的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LZ8

2.4 菌株鑒定結(jié)果

對初篩得到的10株產(chǎn)磷脂酶的菌株進(jìn)行16S rRNA分子鑒定，采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，獲得約1 500 bp的片斷，將測序得到的序列提交至Genbank，通過BLAST與NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道序列進(jìn)行同源性對比，對比結(jié)果如表4所示。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

表4 菌株鑒定結(jié)果Table 4 Results of strain identification

圖1 LZ8的16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain LZ8 based on 16S rRNA sequence analysis

從表4及圖1的菌株鑒定結(jié)果可以看出，產(chǎn)磷脂酶的10株菌經(jīng)鑒定，分屬于4個(gè)屬，即Bacillus、Virgibacillus、Aspergillus、Pichia，其中有7株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），1株屬于畢赤酵母屬（Pichia），而初篩結(jié)果中產(chǎn)酶活力最高的菌株LZ8屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），與最高同源性相似菌株的相似度為100%。

3 結(jié)論

盡管磷脂酶已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但其在天然材料中的含量較低加上其理化性質(zhì)存在的缺陷，導(dǎo)致其無法滿足市場的需要，這一問題也限制了磷脂酶的應(yīng)用前景。目前基因工程的發(fā)展為克服磷脂酶缺陷提供了解決方法，通過基因定點(diǎn)突變及定向進(jìn)化有目的的改造磷脂酶基因，從而改善其穩(wěn)定性和活性，對于提高磷脂酶產(chǎn)生菌酶活力及產(chǎn)量有很大的幫助，因此從分子水平對磷脂酶產(chǎn)生菌進(jìn)行研究，將會(huì)為其工業(yè)化應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用磷脂篩選平板初篩和搖瓶復(fù)篩，從一級郫縣豆瓣中篩選得到一株產(chǎn)磷脂酶菌株LZ8酶活力最高。經(jīng)菌株形態(tài)特征及生理生化特征，結(jié)合16S rRNA序列分析，鑒定其為Bacillus sonorensis。本研究中獲得的產(chǎn)磷脂酶菌株LZ8，為進(jìn)一步該菌株的育種及運(yùn)用基因工程方法構(gòu)建重組磷脂酶工程奠定良好的基礎(chǔ)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)磷脂酶的工業(yè)化生產(chǎn)，開闊磷脂酶的運(yùn)用前景。

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《中國釀造》雜志社

Screening and phylogenetic analysis of phospholipase producing strains in fermented soybean paste

DONG Dan,JIANG Li,GUAN Tongwei,CHE Zhenming*,ZENG Lei
(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, College of Bioengineering,Xihuan University,Chengdu 610039,China)

In this experiment,the first class Pixian soybean paste was used to screen phospholipase-producing strain.The high phospholipase-producing strain was isolated by phospholipase screening plates and shakes flask affiliation,and identified through 16S rRNA sequence analysis.The results showed that ten phospholipase-producing strains were screened out from first class Pixian soybean paste,where the strain named LZ8 had the highest phospholipase-producing activity of 68.32 U/m l.The strain was identified as Bacillus sonorensis,of 100%homology with the highest homology strains.

phospholipase;phylogenetic analysis;enzyme activity;Bacillus

Q939.97

A

0254-5071（2015）03-0044-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.010

2015-01-19

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（No.13205639）；食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（No.Szjj2013-045）；四川省教育廳基金項(xiàng)目資助（No.13205688）

董丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵技術(shù)。