劉 瑞，陳福生，張秀艷*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070）

橘園分離的非釀酒酵母的耐受性分析

劉 瑞1，2，陳福生1，2，張秀艷1，2*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070）

為了更好地利用從橘園分離到的10株非釀酒酵母釀造果酒，對這10株非釀酒酵母的發(fā)酵力，糖、酒精和SO2的耐受性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，不同種的酵母菌發(fā)酵力不同，對酒精、糖和SO2耐受性有很大差異，其中酒精對酵母菌的抑制作用最大。2株釀酒酵母在這些耐受條件下表現(xiàn)良好，雖然有抑制作用，但依然能夠正常生長。自分離的10株非釀酒酵母中，Candida tropicalis和C.humilis發(fā)酵力最高，Issatchenkia orientalis和Torulaspora delbrueckii能夠耐受8%vol的酒精，C.tropicalis，C.humilis和T.delbrueckii能夠耐受260 g/L的葡萄糖，180 mg/L的SO2。

非釀酒酵母；耐酒精能力；耐糖能力；耐SO2能力

柑橘類水果是世界上最主要的亞熱帶水果之一，柑橘果實(shí)營養(yǎng)豐富，不僅含有大量的果膠、低聚糖、有機(jī)酸等營養(yǎng)成分，而且含有多種人體必需的維生素、礦物質(zhì)、類檸檬苦素、生物堿、揮發(fā)油類、類黃酮等具有重要生理功能的成分，使柑橘果實(shí)具有獨(dú)特的風(fēng)味與營養(yǎng)價值[1-2]。

當(dāng)前果酒生產(chǎn)多選用釀酒酵母，優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵快、耐高酒精度、高溫，具有較強(qiáng)的競爭有限營養(yǎng)物的能力，但缺點(diǎn)是果酒風(fēng)味單一[3]。早期研究大多認(rèn)為非釀酒酵母不適合果酒發(fā)酵，因其耐酒精和耐SO2能力差，在果酒生產(chǎn)過程中完全發(fā)酵的能力不夠，近年來人們發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母能生成酯類、高級醇、甘油、醛和琥珀酸等影響果酒感官特點(diǎn)的重要成分[4-5]，據(jù)資料報道，萄葡有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）能分泌更多的高級醇和酯類[4]，報道較多的對果酒風(fēng)味有積極影響的非釀酒酵母有德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii），克勒克酵母屬（Klaeckera）、假絲酵母屬（Candida）和畢赤酵母屬（Pichia）等[6-9]。因此可以利用這10株菌單獨(dú)或與釀酒酵母混合發(fā)酵以產(chǎn)生風(fēng)味各異的柑橘果酒，也可以改善單一菌種帶來的不良影響。

在果酒的釀造過程中，釀酒酵母對高濃度酒精脅迫的耐受性是果酒生產(chǎn)中的重要特性，耐酒精能力強(qiáng)的菌株可以使發(fā)酵完全、徹底，酒精達(dá)到一定濃度后會抑制酵母菌的生長，濃度過高還會使酵母菌中毒致死[10]。糖是酒精發(fā)酵的基質(zhì)，也是酵母賴以生活的能源物質(zhì)。但是高濃度的糖對酵母有抑制作用—葡萄糖阻遏和抑制作用。而且高滲透壓會導(dǎo)致酵母細(xì)胞水分流失，水活性降低。此外，當(dāng)培養(yǎng)基中糖濃度較高時，系統(tǒng)黏度較高，CO2釋放慢[11]，添加適量的SO2，目的是抑制有害微生物生長、阻止果汁的氧化作用、加速膠體的凝集以及有利于葡萄汁澄清，在釀造過程中被廣泛使用[12]。本實(shí)驗(yàn)選取前期研究中從橘園中分離到的160株酵母菌株，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法將其歸為10個酵母菌種。但目前對這些菌株的發(fā)酵力、酒精耐性、糖耐受性、SO2耐受性等并不清楚，只有控制和利用好這些條件，非釀酒酵母在果酒生產(chǎn)中的積極作用才能充分展現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

10種菌為實(shí)驗(yàn)室自分離菌株，來自柑橘園土壤、柑橘果皮和自然發(fā)酵的柑橘汁。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為C.tropicalis、Z.californica、H.uvarum、I.terricola、H.opuntiae、H.occidentalis、C.humilis、I.orientalis、C.lusitania e、T.delbrueckii，對照菌株為S.cerevisiae。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，過濾后121℃濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇中凈化設(shè)備有限公司；UNIC-7200型可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；BL-2200H型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GI80TR型高壓蒸汽滅菌鍋：美國致微儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 非釀酒酵母發(fā)酵柑橘汁能力分析

非釀酒酵母發(fā)酵力分析參見韓珊珊[6]的方法。將活化好的10種非釀酒酵母和2株釀酒酵母菌株按106CFU/m L接種到30 m L柑橘汁中，以釀酒酵母作對照，28℃培養(yǎng)，通過稱質(zhì)量法計(jì)算發(fā)酵液失去的質(zhì)量（即CO2釋放量）。

1.3.2 耐酒精能力測定[13-15]

10 m L液體YPD培養(yǎng)基加入試管中，分別加入無水乙醇調(diào)整初始酒精體積分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%、12%，以釀酒酵母作對照，接種量106CFU/m L，28℃培養(yǎng)48 h，分光光度計(jì)在波長600 nm處測生物量。

1.3.3 耐糖能力測定[13-15]

用葡萄糖調(diào)整初始糖質(zhì)量濃度為100 g/L、140 g/L、180g/L、220g/L，以釀酒酵母作對照，接種量為106CFU/m L，28℃培養(yǎng)48 h。分光光度計(jì)在波長600 nm處測生物量。

1.3.4 耐SO2能力測定[13-15]

將菌株活化，10 m L YPD培養(yǎng)基滅菌之后加入6% H2SO3，調(diào)整初始SO2質(zhì)量濃度為40mg/L、60mg/L、80mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L，以釀酒酵母作對照，接種量106CFU/m L，28℃培養(yǎng)48 h。分光光度計(jì)在波長600 nm處測生物量。

1.35 抑制率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 10株非釀酒酵母發(fā)酵柑橘汁能力分析

圖1 不同非釀酒酵母發(fā)酵柑橘汁的能力Fig.1 Fermentation ability of different non-Saccharomyces

從圖1可以看出，2株S.Cerevisiae分別在24 h和36 h達(dá)到最大發(fā)酵力，達(dá)到最大發(fā)酵力的時間先后順序是Angel S.cerevisiae＞France S.cerevisiae，C.tropicali s，I.terricola，H.opuntiae，C.humilis，H.occidentalis，T.delbrueckii＞H.uvarum＞I.orientalis＞Z.californica＞C.lusitaniae。從發(fā)酵力的高低來看，S.cerevisiae＞C.hum ilis＞H.opuntiae＞H.uvarum，H.occidentalis，T.delbrueckii＞C.tropicalis＞C.lusitaniae＞I.terricola＞I.orientalis＞Z.californica。從發(fā)酵能力持續(xù)時間上來看，2株S.cerevisiae持續(xù)時間短，僅有48 h，而T.delbrueckii的發(fā)酵能力持續(xù)時間長，達(dá)84 h。菌種發(fā)酵能力持續(xù)時間：T.delbrueckii＞C.tropicalis，H.uvarum，H.opuntiae，C.humilis，H.occidentalis＞I.terricola，C.lusitaniae＞S.cerevisiae＞I.orientalis，Z.californica。結(jié)果表明，10株非釀酒酵母的發(fā)酵力不及釀酒酵母，進(jìn)入快速發(fā)酵期時間較長，但是釀酒酵母在發(fā)酵力達(dá)到最大后，發(fā)酵能力迅速下降，而C.tropicalis，H.uvarum，H.occidentalis和T.delbrueckii卻能持續(xù)發(fā)酵。

2.2 10株非釀酒酵母耐酒精能力分析

從圖2可以看出，所有酵母菌株的生長會隨著酒精度的增加而降低。但不同酵母耐受的最大酒精度不同，釀酒酵母在酒精度為12%vol的條件下仍能生長，而非釀酒酵母中，C.tropicalis和I.orientalis，T.delbrueckii在酒精度＞6%vol時生長量有明顯的抑制作用。C.hum ilis和T.delbrueckii在酒精度＜8%vol的條件下生長抑制率分別為55%、70%，這兩株菌在非釀酒酵母中耐受力最強(qiáng)。Z.californica，H.uvarum，I.terricola，H.opuntiae和H.occidentalis在酒精度為6%vol時，抑制率達(dá)100%。

圖2 10株非釀酒酵母耐酒精能力Fig.2 Ethanol tolerance of ten non-Saccharomyces

2.3 10株非釀酒酵母耐糖性能分析

圖3 10株非釀酒酵母耐糖能力Fig.3 Glucose tolerance of ten non-Saccharomyces

從圖3可以看出，隨著初始葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，釀酒酵母和非釀酒酵母的生長會不同程度的受到抑制。釀酒酵母和C.tropicalis、C.humilis、T.delbrueckii在260 g/L高糖質(zhì)量濃度條件下依然能夠正常生長，抑制率為25%。Z.californica、H.uvarum、I.terricola、H.opuntiae、H.occidentalis、I.orientalis和C.lusitaniae這7株酵母達(dá)到50%抑制率（用來反應(yīng)對糖的耐受性高低）所需糖質(zhì)量濃度依次是160 g/L、180 g/L、220 g/L、160 g/L、200 g/L、260 g/L、220 g/L。

2.4 10株非釀酒酵母耐SO2能力分析

圖4 10株非釀酒酵母耐SO2能力Fig.4 SO2tolerance of ten non-Saccharomyces

從圖4可以看出，隨著SO2含量的增加，酵母的生長都不同程度的受到抑制，非釀酒酵母對SO2耐受性要差于釀酒酵母，各SO2含量條件下生長量都低于釀酒酵母。在非釀酒酵母中，Z.californica和有孢漢遜酵母屬的3種菌（H.uvarum，H.opuntiae，H.occidentalis）耐受力最差，C.tropicalis，C.humilis，I.terricola，I.orientalis和T.delbrueckii，對SO2有較高的耐受性，在180 mg/L的SO2含量條件下抑制率為30%。

3 結(jié)論

綜上所述，不同種的酵母菌發(fā)酵力不同以及對酒精、糖和SO2耐受性有很大差異，其中酒精對酵母菌的抑制作用最大。已經(jīng)商業(yè)應(yīng)用的兩株釀酒酵母在這些耐受條件下表現(xiàn)良好，雖然有抑制作用，但依然能夠正常生長，而自分離的10株非釀酒酵母中，C.tropicalis和C.humilis發(fā)酵力最高，I.orientalis和T.delbrueckii能夠耐受8%vol的酒精度，C.tropicalis，C.humilis和T.delbrueckii能夠耐受260 g/L的葡萄糖，180mg/L的SO2。C.lusitaniae耐受6%vol的酒精度，260 g/L的葡萄糖，180 mg/L的SO2。Z.californica，I.terricola和3株有孢漢遜酵母屬的菌株（H.uvarum，H.opuntiae和H.occidentalis），在4%vol的酒精度條件下不能生長，在220 g/L的糖含量、180 mg/L的SO2含量條件下，達(dá)到耐受極限。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中，可以根據(jù)各個菌的耐受能力調(diào)整初始糖度，SO2含量，根據(jù)發(fā)酵能力的大小控制接種量，根據(jù)酒精耐受能力確定混合發(fā)酵中非釀酒酵母的接種時間。

[1]陳茂彬，何平，曾瑩.柑橘酒釀造酵母的篩選及特性研究[J].中國釀造，2007，26（1）：20-23.

[2]廖林，王珊珊.混合果酒釀造工藝研究[J].中國釀造，2014，33（7）：157-160.

[3]趙海霞，華惠敏，吳桂君.野生蘋果酒產(chǎn)香酵母的分離及篩選[J].中國釀造，2014，33（6）：119-122.

[4]崔艷，劉金福.非釀酒酵母在葡萄酒釀造中應(yīng)用的研究現(xiàn)狀[J].中國釀造，2010，29（11）：13-16.

[5]徐亞男，劉秋萍，李琦，等.GC-MS對非釀酒酵母菌發(fā)酵赤霞珠葡萄酒香氣成分的檢測[J].中國釀造，2014，33（6）：135-139.

[6]韓珊珊.檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）在葡萄酒發(fā)酵中的應(yīng)用研究[D].楊陵：西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士論文，2008.

[7]CIANI M,COM ITINI F.Non-Saccharomyces wine yeasts have a promising role in biotechnological approaches to winemaking[J].Ann Microbiol,2013,61(1):25-32.

[8]SUN S Y,GONG H S,JIANG X M,et al.Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae on alcoholic fermentation behavior and wine aroma of cherry wines[J].Food Microbiol,2014,44:15-23.

[9]HONG Y A,PARK H D.Role of non-Saccharomyces yeasts in Korean wines produced from Campbell early grapes:Potential use of Hanseniasporauvarum as a starter culture[J].Food Microbiol,2013,34(1):207-214.

[10]匡鈺，黃和，王玲.菠蘿果酒酵母篩選及發(fā)酵性能測試[J].食品科技，2012，37（3）：5-10.

[11]薛軍俠，徐艷文，楊瑩，等.野生釀酒酵母耐受性分析[J].中國釀造，2007，26（6）：45-47.

[12]薛波，韓娜，侯敏，等.7株葡萄野生酵母菌的特性研究[J].中國釀造，2009，28（10）：19-21.

[13]李進(jìn)，李澤福，都振江，等.低醇半干白葡萄酒的酵母菌耐受性研究[J].中國釀造，2011，30（10）：119-121.

[14]秦偉帥，王海燕，李呂朋，等.不同葡萄酒酵母耐受性試驗(yàn)比較[J].中外葡萄與葡萄酒，2009（9）：16-19.

[15]劉勝，劉品何，韓寧，等.云南德欽產(chǎn)區(qū)野生酵母菌株的耐受性分析[J].中外葡萄與葡萄酒，2013（6）：10-13.

Stress tolerance of non-Saccharomyces isolated from orangery

LIU Rui1,2,CHEN Fusheng1,2,ZHANG Xiuyan1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology,Ministry of Education,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

In order to make better use of non-Saccharomyces isolated from orangery on fruit winemaking,the fermenting power and tolerance of glucose,ethanol and SO2of the strains were analyzed.The results showed that there were evident differences in tolerance among all the measured yeast strains,and tolerance of alcohol on yeast was the maximum.Two S.cerevisiae presented good tolerance,whereas the tolerance of non-Saccharomyces was inferior.From the isolated 10 non-Saccharomyces,Candida tropicalis and C.humilis showed the highest fermenting power,Issatchenkia orientalis and Torulaspora delbrueckii can tolerate 8%vol ethanol,C.tropicalis,C.humilis and T.delbrueckii can tolerate 260 g/L glucose and 180 mg/L SO2.

non-Saccharomyces;ethanol tolerance;glucose tolerance;SO2tolerance

Q 93-336

A

0254-5071（2015）03-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.005

2014-12-20

國家自然科學(xué)基金資助（31071588）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)科研專項(xiàng)基金（200805041071）

劉瑞（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：張秀艷（1973-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。