王紅燕，陶 亮，2，陳 森，李 濤，黃艾祥*

（1.云南農業(yè)大學食品科學技術學院云南昆明650201；2.云南農業(yè)大學植物保護學院云南昆明650201）

貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取工藝研究

王紅燕1，陶 亮1，2，陳 森1，李 濤1，黃艾祥1*

（1.云南農業(yè)大學食品科學技術學院云南昆明650201；2.云南農業(yè)大學植物保護學院云南昆明650201）

以云南西北部地區(qū)的野生植物貫筋藤的鮮莖為原料，在單因素的試驗基礎上，采用L9（33）正交試驗方法，以貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力為評價指標，研究了不同的預處理方式、料液比、浸泡時間、浸泡溫度對其提取工藝的影響，確定了貫筋藤鮮莖中凝乳酶的最佳提取條件和提取率。結果表明，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取最佳條件為料液比1∶20（g∶m L），提取時間40 m in，提取溫度65℃，在此條件下得到的凝乳酶活力為260.984 SU/m L，提取率為31.35%。

貫筋藤；凝乳酶；提取工藝；酶活力；提取率

貫筋藤（Dregea sinensis Hemsl.var.corrugata（Schneid.）Tsiang et P.T.[1]為蘿藦科（Asclepiadaceae）南山藤屬（Dregea E.Mey.，nom.cons.）植物，攀援木質藤本，俗稱“奶漿藤”。貫筋藤生長于海拔500～3 000 m山地森林中或灌木叢中，主產于云南大理、麗江、昆明等地方[2]。據調查，在云南劍川縣、鶴慶縣用“奶漿藤”作為凝乳劑已有多年的歷史，貫筋藤在民間已作為一種天然凝乳劑應用羊奶乳餅的生產。長期以來在加工乳餅（有人稱之為“中國式奶酪”）時，其凝乳劑不是選用通常使用的酸水，而是使用野生植物貫筋藤莖桿水溶液作為凝乳劑，產品較常規(guī)酸凝法生產的乳餅具有更濃郁的清香風味和較高的成品率。

隨著乳品行業(yè)的高速發(fā)展，人們對發(fā)酵乳制品的需求也日益增加。在干酪生產中，凝乳酶因其可以專一地切割乳中k-酪蛋白的苯丙氨酸（Phe）105-蛋氨酸（Met）106之間的肽鍵[3]，破壞酪蛋白膠束使牛奶凝結，并由蛋白水解作用產生特有風味，成為重點研究的酶制劑。但由于小牛凝乳酶無法滿足現代工業(yè)的需求且成本較高，國內外學者致力于尋找植物源凝乳酶的替代品，近年來，關于凝乳劑的研究較多，菠蘿蛋白酶[4]、刺菜薊[5]、生姜蛋白酶[6]等植物凝乳酶及其他凝乳劑[7-8]相繼被研究。

黃艾祥等[9-10]發(fā)明了貫筋藤天然植物凝乳劑，孫海蛟等[11-12]研究了貫筋藤中的凝乳活性物質，都是以貫筋藤干莖為實驗材料。本研究以貫筋藤鮮莖為原料，以其酶活力和提取率為指標，通過正交試驗優(yōu)化貫筋藤凝乳酶的提取工藝，確定貫筋藤鮮莖中凝乳酶的最佳提取條件和提取量，為尋找一種天然綠色植物凝乳劑及其替代品提供參考和理論依據，這對云南地方資源的開發(fā)利用具有一定的推動作用，同時對我國干酪產業(yè)的發(fā)展也具有重大而深遠的理論和現實意義[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貫筋藤鮮莖：采自云南大理州劍川縣，海拔2 000～3 000 m山地森林中或灌木叢中；山羊奶：昆明市易興恒畜牧科技有限公司種羊胚胎基地。

硫酸銨（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1700紫外可見光譜儀：日本島津公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；CP153電子天平：奧豪斯儀器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；HI99161 pH計：意大利哈納儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50真空冷凍干燥機：上海比朗儀器有限公司；78-2型磁力攪拌器：常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 貫筋藤凝乳酶的提取工藝流程

貫筋藤鮮莖→洗滌→敲碎→浸泡→抽濾→離心→濃縮→鹽析→分級→透析→冷凍干燥→貫筋藤凝乳酶干粉→低溫保藏（-20℃）。

1.3.2 操作要點

（1）貫筋藤凝乳酶水提液的制備

選取新鮮的粗細均勻的貫筋藤莖洗凈，均勻敲碎放入一定溫度的超純水中浸泡一段時間后取出，放置室溫條件下冷卻10 min，將水提貫筋藤后的浸泡液過120目4層紗布，過濾兩次，所得上清液即為含有凝乳成分的貫筋藤水提液。

（2）貫筋藤凝乳酶水提液的濃縮

貫筋藤水提液經5 000 r/min離心15 min除雜后，使用旋轉蒸發(fā)儀對不同料液比提取的貫筋藤蛋白酶原液濃縮，得到10倍原貫筋藤質量濃縮酶液，4℃冷藏24 h。

（3）貫筋藤凝乳酶的分級提取

取出冷藏24 h后的貫筋藤濃縮液，采用硫酸銨分級沉淀，4 000 r/min離心20 min。

（4）貫筋藤凝乳酶的透析除雜

樣品分別加入截留分子質量（molecular weight cut off，MWCO）3 500 u的透析袋中，放置于大燒杯內透析20 h，多次更換透析液。塑料燒杯收集透析后溶液放入-80℃冰箱迅速冷凍，然后放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥，制得貫筋藤凝乳酶干粉。

1.3.3 單因素試驗

分別設置對貫筋藤鮮莖的預處理方式為粉碎、切片、敲斷、料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶m L）、浸泡溫度分別為35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，浸泡時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 m in，以凝乳酶活力作為評價指標，考察各因素變量對貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力的影響。

1.3.4 貫筋藤鮮莖中凝乳酶提取最佳條件的優(yōu)化

利用單因素試驗探究不同的預處理方式、料液比例、浸泡時間、浸泡溫度對提取的貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力的影響。在此基礎上選擇料液比、浸泡時間、浸泡溫度，進行3因素3水平的正交試驗，以凝乳酶活力為評價指標，通過方差分析優(yōu)化凝乳酶的最佳提取條件，正交試驗因素及水平見表1。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.5 貫筋藤凝乳酶活力的測定

采用修正ARIMA K等[14]法，取50 m L新鮮山羊乳，加熱至85℃后恒溫下水浴，加入為羊奶體積35%（17.5 m L）的貫筋藤溶液，充分混合后繼續(xù)水浴。準確記錄從加入貫筋藤溶液到羊乳凝固的時間。凝乳酶活力定義為：40 min凝固1 m L山羊乳的酶量（貫筋藤溶液用量）為1個索氏單位（Soxhelt unit，SU）。凝乳酶活力計算公式如下：

X=2 400×50×D/（t×17.5）

式中：X為凝乳酶活力，SU/m L；t為凝乳時間，m in；D為貫筋

藤溶液或粗酶液的稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 貫筋藤浸泡前預處理方式對凝乳酶活力的影響

選取粗細均勻的貫筋藤鮮莖，將其清洗干凈，分別經過粉碎、切片、敲碎預處理后，測其水提液的凝乳酶活力，結果如圖1所示。

圖1 不同的處理方式對貫筋藤凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of different pretreatments methods on rennet activities

由圖1可知，不同的預處理方式對貫筋藤鮮莖的凝乳酶活力的影響不同，粉碎處理制作的貫筋藤水提液的凝乳酶活力為74.696SU/m L，明顯低于切片和敲碎的，其中敲碎處理的貫筋藤水提液凝乳酶活力最高，其活力為198.740SU/m L。由于快速粉碎處理會破壞貫筋藤鮮莖中的內溶物，切片處理封閉、堵塞了貫筋藤植物莖稈的導管和篩管，導致在浸泡時凝乳酶浸出率低，凝乳酶活力低。為提高凝乳酶的活力，選擇貫筋藤鮮莖的預處理方式為敲碎。

2.1.2 料液比對貫筋藤凝乳酶活力的影響

料液比對貫筋藤凝乳酶活力的影響結果如圖2所示。

圖2 料液比對凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on rennet activities

由圖2可知，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的活力隨料液比的增大而增加，當料液比增大至1∶20（g∶m L）時，凝乳酶的活力達到220.009 SU/m L，繼續(xù)增大料液比，凝乳酶的活力略有增大，但變化較小，基本趨于穩(wěn)定，這是因為當料液比達到1∶20（g∶m L）時，酶已全部浸提出。因此選擇1∶20（g∶m L）的料液比為宜。

2.1.3 浸泡時間對貫筋藤凝乳酶活力的影響

浸泡時間對貫筋藤凝乳酶活力的影響結果如圖3所示。

圖3 浸泡時間對凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of extraction time on rennet activities

由圖3可知，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的活力隨浸泡時間的延長而增大，當浸泡時間達到40 m in時凝乳酶的活力最高為285.011 SU/m L，浸泡時間＞40 min凝乳酶的活力開始降低。原因可能是浸泡時間過短，凝乳酶沒有完全溶解，當時間延長到一定程度時才全部溶解，繼續(xù)延長時間，凝乳酶的活力會在長時間的保溫過程中逐漸減小，即酶的活力與在一定溫度下保持的時間長短有關[15]，因此浸泡時間選擇40 min為宜。

2.1.4 浸泡溫度對貫筋藤凝乳酶活力的影響

浸泡溫度對貫筋藤凝乳酶活力的影響結果如圖4所示。

圖4 浸泡溫度提取凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on rennet activities

由圖4可知，在一定溫度范圍內，凝乳酶的活力隨著溫度的升高而增加。當浸泡溫度達到65℃時，凝乳酶的活力最高為289.993 SU/m L，浸泡溫度＞65℃后凝乳酶的活力又隨溫度的升高而降低。這主要是因為隨著溫度的升高，分子間的運動速度加快，凝乳酶易于溶解出來，但溫度過高會使凝乳酶變性，影響凝乳酶的活力[9]。所以65℃為凝乳酶提取的適宜溫度。

2.2 貫筋藤鮮莖中凝乳酶提取最佳條件的確定

在單因素試驗的基礎上，對貫筋藤鮮莖的凝乳酶提取條件進行正交試驗設計，分別選取料液比，浸泡時間和浸泡溫度，進行3因素3水平L9（33）正交試驗，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 提取條件優(yōu)化正交試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

由表2可知，3個因素中影響貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力最主要的因素是浸泡溫度，其次是浸泡時間和料液比，即影響貫筋藤凝乳酶活力的因素次序為C＞B＞A，提取凝乳酶的較優(yōu)水平組合是A2B2C3，即提取貫筋藤鮮莖中凝乳酶的最佳條件為料液比1∶20（g∶m L），浸泡時間40 min，浸泡溫度65℃，在此條件下，進行3次重復的驗證試驗，測得貫筋藤凝乳酶活力為260.984 SU/m L。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，方差分析結果表明，在進行貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取試驗過程中，料液比、浸泡時間、浸泡溫度對貫筋藤鮮莖中凝乳酶活力的影響均不顯著。

2.3 貫筋藤鮮莖中凝乳酶提取率與酶活力相關性

貫筋藤鮮莖中的凝乳酶活力與對應組別的凝乳酶提取率關系結果如圖5所示。

圖5 凝乳活力與提取率的關系Fig.5 Correlation of milk clotting activity and extraction rate

由圖5可知，貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取率隨著凝乳酶活力的增大而升高，對這兩組數據進行相關性分析，兩者的Person相關系數為0.932，顯著水平P＜0.01，兩者存在極顯著的正線性相關，即凝乳酶活力最高時，相應的提取率也最高[10]，因此在最佳提取條件下，進行3次重復試驗，取其平均值，測得貫筋藤鮮莖中凝乳酶的提取率為31.35%。

3 結論

結果表明，貫筋藤的鮮莖中也含有凝乳酶。考察不同的預處理方式、料液比、浸泡時間、浸泡溫度對凝乳酶活力的影響，最終對貫筋藤鮮莖采用敲碎的預處理方式，以此為基礎，設計3因素3水平的正交試驗，分析得出凝乳酶提取的最佳條件為料液比1∶20（g∶m L），浸泡時間40 min，浸泡溫度65℃。在此條件下，測得的凝乳酶活力為260.984 SU/m L，提取率為31.35%。

相關性試驗結果表明，凝乳酶活力與提取率呈正線性相關。

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Extraction process of rennet from fresh stalk of Dregea sinensis Hemsl

WANG Hongyan1,TAO Liang1,2,CHEN Sen1,LI Tao1,HUANG Aixiang1*
(1.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunm ing 650201,China; 2.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

The fresh stalk of wild Dregea Sinensis Hemsl from the northwest of Yunnan province was researched.On the basis of single factor test,using rennet activity as evaluation index,the effects of different pretreatments,solid-liquid ratio,extraction time and temperature on enzyme activity of D.sinensis Hemsl fresh stalk was studied.Optimal extraction conditions were determined by three factors and three levels orthogonal experiment. The results showed that the optimal extraction process of rennet from D.sinensis Hem sl was solid-liquid ratio 1∶20(g∶m l),extraction time 40 m in,extraction temperature 65℃.Under this condition,the rennet activity was 260.984 SU/m l,the rennet extraction rate was 31.35%.

Dregea sinensis Hemsl;rennet;extraction process;enzyme activity;extraction rate

TS202.3

A

0254-5071（2015）03-0034-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.008

2015-01-18

國家自然科學基金資助項目（31160331）；云南省高校食品加工與安全控制重點實驗室項目（云教科（2014）16號）

王紅燕（1989-），女，碩士研究生，研究方向為乳制品加工與質量安全。

*通訊作者：黃艾祥（1963-），男，教授，博士，研究方向為乳制品加工。