胡雪蓮，王宏華，王莉娜

（北京燕京啤酒集團(tuán)公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京101300）

高效液相色譜法測(cè)定黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸

胡雪蓮，王宏華，王莉娜

（北京燕京啤酒集團(tuán)公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京101300）

建立了一種黑莓果汁及黑莓啤酒中測(cè)定γ-氨基丁酸的高效液相色譜法。采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)為柱前衍生試劑，色譜柱為Waters AccQoTagTM氨基酸分析柱，梯度洗脫，紫外檢測(cè)波長248 nm。結(jié)果表明γ-氨基丁酸線性方程為y=21 012x+155 852，在1～1 000 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，綜合黑莓原汁、濃縮汁及黑莓啤酒樣品的結(jié)果，加標(biāo)回收率為87.9%～114.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～12.3%，檢出限為0.7 mg/L。采用此法檢測(cè)黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果穩(wěn)定性好。

6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯；柱前衍生；高效液相色譜；γ-氨基丁酸；黑莓果汁；黑莓啤酒

黑莓是新興的漿果類水果[1]，除少部分直接鮮食外，大部分用于加工制成果汁、果醬、速凍干果等食品[2]。黑莓富含維生素、粗蛋白、糖、超氧化物歧化酶及硒等多種有益元素，黑莓中的氨基酸含量較高，并且富含γ-氨基丁酸[3]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又稱氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸，為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[4]，已有研究表明，GABA具有激活腦內(nèi)葡萄糖代謝、促進(jìn)乙酰膽堿合成、降血氨、抗驚厥、降血壓、恢復(fù)腦細(xì)胞的功能等多種藥理作用[5]。GABA作為一種新型的功能食品因子，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于飲料、果醬、糕點(diǎn)、餅干、調(diào)味品等制品中[6]。啤酒是一種深受廣大消費(fèi)者喜愛的低酒精度飲料，如能將黑莓與啤酒的釀造過程有機(jī)結(jié)合而研制出黑莓啤酒，既能保持啤酒的固有風(fēng)格，又能突出黑莓的獨(dú)特口味而使啤酒具有一定的保健功能，將為黑莓的深加工找到一條新路，也將極大地豐富啤酒的花色品種，滿足各層次消費(fèi)者的需求。

目前國內(nèi)外對(duì)GABA測(cè)定的方法主要有酶法、毛細(xì)管電泳法、紙層析法、比色法、氣相色譜法、液相色譜法[7-12]等。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜法因其樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，方法準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度較高，在測(cè)定食品的應(yīng)用中日益廣泛。目前已有對(duì)三七地上部分[13]、南瓜葉[14]和紅茶[15]中γ-氨基丁酸含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。本研究采用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（6-aminoquinoline-N-hydroxysuccinimido carbamate，AQC）作衍生試劑，對(duì)黑莓果汁及黑莓啤酒中γ-氨基丁酸的含量進(jìn)行測(cè)定。衍生產(chǎn)物中的喹啉基團(tuán)是提高檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵，生成在室溫條件下可穩(wěn)定一周的高穩(wěn)定性的脲，衍生物經(jīng)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分離后經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，可得到理想的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)建立了黑莓果汁及黑莓啤酒中γ-氨基丁酸高效液相色譜分析方法，為黑莓啤酒的進(jìn)一步研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓原汁、黑莓濃縮汁：市售；試驗(yàn)酒：燕京小試開發(fā)黑莓啤酒。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣品：美國Sigma公司；乙腈（色譜級(jí)）：美國Fisher公司；AccQ·FlourTM衍生試劑盒（1硼酸鹽緩沖液；2B稀釋液；2A衍生試劑粉末）、AccQ·Tag流動(dòng)相A濃液：美國Waters公司；Milli-Q超純水：德國Merck Millipore公司；85%磷酸（分析純）：北京化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2489液相色譜儀（真空脫氣器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器）：美國Waters公司；MVS-1型旋渦混合器：北京金北德工貿(mào)有限公司；Eppendorf Centrifuge 5430R離心機(jī)：德國Eppendorf艾本德公司；101-3EBS型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 衍生試劑的配制

AccQ·FLourTM試劑盒中的2A瓶，裝有稱量好的的衍生劑粉末，用乙腈配制后即得10 mmol/L的AccQ·FLourTM衍生試劑。配制方法如下：將干燥箱預(yù)熱至55℃；吸取1 m L 2B稀釋劑放入2A瓶中，加蓋密封；搖蕩10 s；置干燥箱中加熱，至衍生劑粉末全部溶解。加熱時(shí)間一般需要30 m in，若有不溶物，可適當(dāng)延長加熱時(shí)間，備用。

1.3.2 樣品處理

黑莓果汁：將黑莓果汁搖勻，倒入離心管中，于6 000 r/min的條件下離心10m in，取上清液，經(jīng)0.2μm濾膜過濾后備用。取10 μL濾液至干凈的6 mm×50 mm樣品衍生管底部，吸取70 μL硼酸鹽緩沖液（pH值為8.8）至樣品管中，渦旋混合，再吸取20 μL AQC衍生試劑到樣品管中，立即渦旋混勻10 s，室溫放置1 m in；用石蠟?zāi)し饪?，?5℃干燥箱內(nèi)加熱10min，取出轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，10μL進(jìn)樣，供HPLC分析。

黑莓濃縮汁：需用水稀釋10倍，其他處理同上。

黑莓啤酒：取50 m L樣品用折疊濾紙過濾除氣，再用0.2 μm濾膜過濾備用。其他處理同上。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取100 mgγ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)至100 m L容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，配制成1 000 mg/L的貯備液，冷藏備用。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用水把貯備液稀釋成40.0mg/L（現(xiàn)用現(xiàn)配）。取10 μL該工作標(biāo)準(zhǔn)溶液至干凈的6 mm×50 mm樣品衍生管底部，吸取70 μL硼酸鹽緩沖液（pH值8.8）至樣品管中，渦旋混合，再吸取20 μL AQC衍生試劑到樣品管中，立即渦旋混勻10 s，室溫放置1 m in；用石蠟?zāi)し饪?，?5℃干燥箱內(nèi)加熱10 min，取出轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，10 μL進(jìn)樣，供HPLC分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters AccQ·TagTM氨基酸分析柱（3.9 mm× 150 mm，4 μm）；流動(dòng)相A：AccQ·Tag A濃液與水1∶10（V/V）稀釋；流動(dòng)相B：100%乙腈；流動(dòng)相C：100%水。流速：1 m L/min；梯度洗脫程序如表1所示；檢測(cè)波長：248 nm；柱溫：37℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program table

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

用HPLC法測(cè)定黑莓果汁中的GABA含量時(shí)，流動(dòng)相組成及配比影響被分析物的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，以AccQ·Tag氨基酸分析方法為基礎(chǔ)，采用AccQ·Tag A濃液與水稀釋液1∶10（V/V）、乙腈、水溶液為流動(dòng)相，參照該方法中的梯度，未能使GABA與其他成分有效分離。為了避免雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰的干擾，在雜質(zhì)出峰時(shí)間段（19～26 min）對(duì)流動(dòng)相配比進(jìn)行調(diào)整（表1），γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和典型樣品的色譜圖見圖1。

圖1 γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(a)和黑莓原汁(b)、黑莓濃縮汁(c)、啤酒樣品(d)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of γ-aminobutyric acid standard solution(a),blackberry juice(b),blackberry concentrated juice(c)and blackberry beer(d)

由圖1可知，在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液在AccQ·TagTM色譜柱上得到了很好的洗脫和分離，γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品在柱上的保留時(shí)間是22.591m in。從色譜圖可以看出，其他雜質(zhì)對(duì)測(cè)定沒有干擾，該方法能很好的對(duì)GABA進(jìn)行分離。采用以上色譜條件檢測(cè)黑莓果汁中的GABA含量，目標(biāo)峰峰形尖銳，分離度好，保留時(shí)間合適，方法專屬性良好。2.2線性關(guān)系和靈敏度

圖2 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of γ-aminobutyric acid

將標(biāo)準(zhǔn)貯備液適當(dāng)稀釋，配制成系列質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.4條件下依次測(cè)定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見圖2。其線性回歸方程為y=21 012x+ 155 852，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4，線性范圍為0～1 000 mg/L，并以3倍信噪比，得出方法檢出限為0.7 mg/L。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，靈敏度較高。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

選取黑莓原汁、黑莓濃縮汁和黑莓啤酒樣品，分別添加不同質(zhì)量濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度做6個(gè)平行樣品。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，均扣除本底值后計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，GABA在黑莓原汁中的加標(biāo)回收率為97.7%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～9.1%；在黑莓濃縮汁中的加標(biāo)回收率為87.9%～114.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差試驗(yàn)（relative standard deviation，RSD）為5.7%～10.9%，在黑莓啤酒中的加標(biāo)回收率為90.5%～112.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%～12.3%。本方法的準(zhǔn)確度及精密度能滿足黑莓果汁及黑莓啤酒中GABA的分析要求。

2.4 樣品的檢測(cè)與分析

應(yīng)用本方法對(duì)市售黑莓果汁產(chǎn)品及試驗(yàn)中黑莓啤酒樣品進(jìn)行測(cè)定（3種黑莓原汁；2種黑莓濃縮汁；5種黑莓啤酒），其γ-氨基丁酸含量檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸含量Table 3 γ-aminobutyric acid content in blackberry juice and blackberry beer

從表3結(jié)果可以看出，黑莓原汁的GABA含量為224.8～247.3 mg/L，黑莓濃縮汁的含量為2 053.6～2 101.3 mg/L，黑莓啤酒中GABA的含量為65.5～73.1 mg/L。

3 結(jié)論

建立了一種測(cè)定黑莓果汁及黑莓啤酒中GABA高效液相色譜方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了精密度和準(zhǔn)確度的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，綜合黑莓原汁、濃縮汁及黑莓啤酒樣品的結(jié)果，該法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～12.3%；樣品中加標(biāo)回收率為87.9%～114.9%，可以滿足對(duì)黑莓啤酒及果汁中GABA的檢測(cè)要求；本方法靈敏度高，專一性強(qiáng)，檢出限為0.7 mg/L?？勺鳛橘|(zhì)量監(jiān)督控制的有效方法，為其穩(wěn)定生產(chǎn)提供高效的技術(shù)保障。

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《中國釀造》雜志社

Determination of γ-aminobutyric acid in blackberry juice and blackberry beer by HPLC

HU Xuelian,WANG Honghua,WANG Lina
(Beijing Key Laboratory of Beer Brew ing Technology,Technical Center of Beijing Yanjing Beer Group Corporation,Beijing 101300,China)

The determination method forγ-aminobutyric acid in blackberry juice and blackberry beer was established by HPLC.Using 6-amino quinolyl-N-hydroxy succinimidyl carbamate(AQC)as pre-column derivatization reagent,and Waters AccQoTagTM amino acid column as analysis column,gradient elution was conducted and the detection wavelength was 248 nm.The results showed that the linear equation was y=21 012x+155 852, γ-aminobutyric acid presented good linear relationship in the range of 1-1 000 mg/L,the correlation coefficient R2=0.999 4.The comprehensive recovery rate results of blueberry juice,concentrated juice and blueberry beer was 87.9%-114.9%,the relative standard deviation was 2.7%-12.3%, and the detection lim it was 0.7 mg/L.This method was simple for γ-aminobutyric acid determination in blackberry juice and blackberry beer,and the results showed good stability.

AQC;pre-column derivatization;HPLC;γ-aminobutyric acid;blackberry juice;blackberry beer

O 652.1

A

0254-5071（2015）03-0150-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.036

2015-01-12

燕京啤酒集團(tuán)公司內(nèi)部課題

胡雪蓮（1985-），女，工程師，本科，研究方向?yàn)闄z驗(yàn)分析。