張 翼，陳雅蘅，周幗萍,*，楊祖順

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.云南省疾病預防控制中心，云南 昆明 650022）

克羅諾桿菌的生物膜檢測和藥敏性分析

張 翼1，陳雅蘅1，周幗萍1,*，楊祖順2

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.云南省疾病預防控制中心，云南 昆明 650022）

目的：了解38 株主要來源于我國嬰幼兒食品克羅諾桿菌分離株的生物膜形成能力和藥敏性。方法：首先用fusA序列分析，對43 株克羅諾桿菌進行準確鑒定；采用半定量黏附實驗（結(jié)晶紫染色法）測定分離株的生物膜形成能力，并選用八大類11 種抗生素測定其抗生素敏感性。結(jié)果：鑒定出34 株阪崎克羅諾桿菌、7 株丙二酸鹽克羅諾桿菌和2 株都柏林克羅諾桿菌。這些克羅諾桿菌分離株均有一定生物膜成膜能力，其中丙二酸鹽克羅諾桿菌的成膜能力較強；菌株普遍對四環(huán)素和萬古霉素耐藥性較高，共有14 個耐藥譜；四環(huán)素的耐藥性與生物膜形成能力有顯著相關(guān)性。結(jié)論：實驗結(jié)果表明克羅諾桿菌的成膜性和耐藥性都較強，對相關(guān)食品企業(yè)的消殺措施和臨床治療提出了挑戰(zhàn)。

克羅諾桿菌；鑒定；生物膜；抗生素敏感性

克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌，耐高溫、酸和干燥，對環(huán)境有比較強的抵抗力，廣泛分布在食品和環(huán)境中[1]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）于2004年在日內(nèi)瓦召開的有關(guān)聯(lián)席會議中指出奶粉中的克羅諾桿菌等是導致嬰幼兒感染、疾病以及死亡的主要原因，特別是早產(chǎn)兒、出生體質(zhì)量較低或免疫力低下的嬰幼兒，能引起嚴重的嬰幼兒敗血癥、腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎，神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等疾病，甚至導致嬰幼兒死亡[2-4]?？肆_諾桿菌對危重患者、老人等免疫力低下人群的感染也會引發(fā)較嚴重的后果[5]。

2007年Iversen[6-7]、Joseph[8]、Brady[9]等根據(jù)表型和基因型特征將阪崎腸桿菌成立為腸桿菌科中的一個新屬——克羅諾屬，目前該屬共有10 個種：阪崎克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌、莫金斯克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌、康帝蒙提克羅諾桿菌、尤尼沃斯克羅諾桿菌、C. zurichensis、C. helveticus、C. pulveris。阪崎腸桿菌的常規(guī)鑒定和分類主要依據(jù)生理生化性質(zhì)[10]，但已發(fā)現(xiàn)生化分型與基因組測序和MLST分子分型結(jié)果有偏差，已不再適用于鑒別該屬下種的劃分。國際標準等依據(jù)生理生化鑒定方法與國際最新分類體系出現(xiàn)了偏離，這不僅是分類學的問題，也涉及到阪崎腸桿菌的安全性評價。因為目前發(fā)現(xiàn)只有阪崎克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌對人類有感染力，尤其值得重視的是阪崎克羅諾桿菌與嬰幼兒腦膜炎密切相關(guān)[11-12]。

生物膜是細菌為了適應環(huán)境和維持自身生命而發(fā)生的形態(tài)學變化，具有抵抗機體免疫系統(tǒng)的能力[13]，并增強了細菌對外界環(huán)境的抵抗力[14]。生物膜對于食品工業(yè)衛(wèi)生有重大影響，因為食物包裝材料及設備加工表面形成的生物膜可能導致常規(guī)清潔、消毒、殺菌方法失效，進而造成長期持續(xù)性污染，為食品企業(yè)帶來風險隱患[15]。了解食源性致病菌的生物膜產(chǎn)生能力對食品企業(yè)分析潛在的污染源頭，并消除污染隱患有所助益。

由于濫用抗生素等因素，近年來克羅諾桿菌等細菌的耐藥性不斷增加[16]，細菌的耐藥性給臨床治療帶來諸多困難，對人類健康造成威脅[17]，研究微生物的耐藥性和耐藥機制，加強對細菌的耐藥檢測，合理地選用抗菌藥物以減少細菌耐藥性發(fā)生，對于控制和治療由該食源性微生物引起的感染具有重要意義[18]。

本研究對從食品中分離的38 株克羅諾桿菌及5 株標準株，按照最新分類體系鑒定到種后，分析其生物膜形成能力及其對抗生素的敏感性，以期為研究克羅諾桿菌及治療由其引起的感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

對34 株來自我國嬰幼兒食品的分離株、4 株食品原料分離株、2 株標準株（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）和美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC））、3 株丹麥實驗室提供的菌株共計43 株克羅諾桿菌進行分析。菌株的分離和初步鑒定依據(jù)GB 4789.40—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》。蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579及ATCC 10987分別作為生物膜形成能力檢測方法實驗中的陽性和陰性對照株，大腸桿菌ATCC 29522則為藥敏標準中質(zhì)控菌株。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基、水解酪蛋白培養(yǎng)基、藥敏試紙 北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑2×Taq PCR Master Mix 北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；YM50AI全自動滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；A-5082 DNA Expert酶標儀 瑞士Tectan公司；96孔酶標板 美國康寧公司。

1.3 方法

1.3.1 fusA序列分析

對數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://pubmlst.org/cronobacter/）所列克羅諾桿菌的7 對管家基因中的fusA進行PCR擴增，PCR反應產(chǎn)物由蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，對測序結(jié)果進行編輯和核對后提交給MLST數(shù)據(jù)庫，獲得編號ID和等位基因型，并用Splitstree4軟件進行聚類分析。

1.3.2 生物膜檢測[19]

采用結(jié)晶紫染色法進行半定量分析：每個96 孔板上均有蠟樣芽孢桿菌ATCC14579及ATCC10987這2 個標準對照組和1 個空白培養(yǎng)基組，每個菌株設3 個重復。具體實驗方法如下：LB平板30 ℃、24 h活化菌株；新96 孔平板每孔加200 μL的無菌LB培養(yǎng)液；接種：30 ℃培養(yǎng)72 h；棄菌液：1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗、室溫干燥，加200 μL的結(jié)晶紫染色20 min，棄染液，1×PBS清洗3 次，室溫干燥；加160 μL的丙酮-乙醇溶液（20∶80，V/V）溶解，測595 nm波長處的光密度值（OD595nm）。

1.3.3 藥敏實驗方法[20]

美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的抗微生物藥物敏感性實驗操作方法和判斷標準，也是國內(nèi)臨床細菌檢驗遵循的標準，故采取CLSI 2005版中K-B紙片擴散法進行，以ATCC25922大腸桿菌做質(zhì)控。按推薦的腸桿菌藥敏實驗抗生素選擇原則，結(jié)合臨床用藥和研究需要，共選擇了八大類11 種抗生素，結(jié)果見表1。

表1 藥敏實驗中所選用的抗生素Table 1 Antibiotics used in the susceptibility testing

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

使用軟件SPSS19.0統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 fusA序列分析

截至2014年11月23日在克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫中收集了自1950年以來全球超過38 個國家1 078 個菌株共329 個ST型的信息。采用Splitstree4分析數(shù)據(jù)庫中7 個管家基因的序列，發(fā)現(xiàn)fusA基因是進化最穩(wěn)定的基因，但其序列多樣性又可準確區(qū)分最新分類系統(tǒng)中的該屬下10 個種（圖1），所以選用fusA基因序列分析做菌種鑒定。提交fusA基因序列給數(shù)據(jù)庫獲得等位基因型和菌株編號見表1，再依據(jù)圖1鑒定到種。該鑒定結(jié)果和ropB序列分析及MLST分型結(jié)果一致（待發(fā)表），說明其結(jié)果可信。

A管家基因的Splitstree4分析Fig.1 Splitstree4 analysis of fusA housekeeping gene in MLST database圖1 MLST數(shù)據(jù)庫中fus

其中，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心的標準株CICC21544登記的是阪崎腸桿菌，根據(jù)fusA序列分析結(jié)果鑒定為丙二酸鹽克羅諾桿菌（圖1）。

2.2 生物膜形成能力

表2 克羅諾桿菌分離株信息Table 2 Profile of Cronobacter isolates

由表2可知，蠟樣芽孢桿菌ATCC14579是生物膜形成能力較強的菌株（均值1.470 8±0.223 5），蠟樣芽孢桿菌ATCC10987是生物膜形成能力較弱的菌株（均值0.383 9±0.092 1），將其分別作為陽性和陰性對照監(jiān)測生物膜檢測方法的穩(wěn)定性和可比性。將43 株菌株按照克羅諾屬中不同種之間進行生物膜形成能力的比較，結(jié)果見圖2。阪崎克羅諾桿菌的成膜能力較弱，而丙二酸鹽克羅諾桿菌的成膜能力較強，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 克羅諾桿菌分離株的3 個種之間生物膜形成能力比較Fig.2 Comparison of biofilm-forming capability among three Cronobacter species

2.3 藥敏實驗結(jié)果

2.3.1 藥敏實驗檢驗結(jié)果

表3 藥敏實驗結(jié)果Table 3 Results of antibiotic susceptibility testing

由表3可知，43 株克羅諾桿菌對萬古霉素和四環(huán)素耐藥性較高，分別為93.0%和83.7%；而對氨芐西林、慶大霉素、奈替米星最為敏感；對頭孢菌素類抗生素頭孢唑啉和頭孢噻肟的敏感率比較相似。藥敏結(jié)果與相關(guān)文獻報道較為一致[21]。

值得注意的是文獻普遍認為克羅諾桿菌對萬古霉素抗性可達100%，而本實驗結(jié)果中43 株中并非都對萬古霉素有抗性，如果參照腸球菌（G+）標準來看，僅有93%菌株對萬古霉素有耐藥性，而非100%抗性。

2.3.2 菌株的耐藥譜分析

由表4可知，43 株克羅諾桿菌至少對一種抗生素有抗性，一共有14 個耐藥譜，耐兩種以上抗生素的菌株有38 株，耐3 種以上抗生素的多重耐藥菌株有12 株。最常見的兩種耐藥譜依次是TET-VA（51.2%），TET-SMX-VA（11.6%），多重耐藥菌株最多可同時對5 種抗生素耐藥（TET-CHL-SMX-CTX-VA）。說明克羅諾桿菌的耐藥性問題比較嚴重，但尚未發(fā)現(xiàn)對臨床時針對克羅諾桿菌常用的氨芐青霉素-氨基糖苷類抗生素如：AMP-GEN/NTL/KAN的雙重耐藥型菌株，也就是說臨床目前使用的抗生素組合依然有效。

表4 分離株的耐藥譜分析Table 4 Analysis of drug resistant spectrum

2.3.3 3 種克羅諾桿菌對不同抗生素的敏感率比較

表53 種克羅諾桿菌對抗生素的敏感率Table 5 Comparison of antibiotic susceptibility among three Cronobacter species %

由表5可知，有7 株丙二酸鹽克羅諾桿菌均對氨芐西林、慶大霉素、氯霉素、卡那霉素和奈替米星敏感；但阪崎克羅諾桿菌對臨床常用藥氨芐西林（97.1%）、慶大霉素（97.1%）、卡那霉素（70.6%）和奈替米星（97.1%）敏感率均不足100%；不同種的菌株間對四環(huán)素的敏感率差別顯著。

2.3.4 生物膜形成能力與耐藥性的相關(guān)性

本實驗對分離株生物膜形成能力和藥敏實驗結(jié)果抑菌圈直徑大小進行相關(guān)性分析，四環(huán)素耐藥性與生物膜形成能力有顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)－0.364，P＜0.05），其他抗生素的抗藥性和生物膜形成能力的數(shù)據(jù)相關(guān)性不大。

2.3.5 武漢分離株和云南CDC分離株耐藥率比較

武漢（武漢輕工大學生化樓605實驗室）分離株和云南（云南CDC）分離株耐藥率比較如圖3，可見云南分離株在頭孢唑林、慶大霉素、氯霉素、磺胺的耐藥率上高于武漢分離株；而武漢株在四環(huán)素和奈替米星的耐藥率高于云南株。各個地區(qū)對不同抗生素的耐藥率顯示出差異，尤其是以磺胺抗性差異顯著。

圖3 武漢分離株和云南分離株耐藥率比較Fig.3 Comparison of drug resistance rate of isolates from Wuhan and Yunnan

3 討 論

本實驗中43 株菌株分別鑒定為34 株阪崎克羅諾桿菌、7 株丙二酸鹽克羅諾桿菌和2 株都柏林克羅諾桿菌。除2 株標準株及1 株臨床株外均為食品分離株（其中36 株菌株來自嬰幼兒食品），其中有32 株阪崎克羅諾桿菌（78.9%），6 株丙二酸鹽克羅諾桿菌（15.8%）和2 株都柏林克羅諾桿菌（5.3%）。值得關(guān)注的是：在克羅諾桿菌10 個種中，對嬰幼兒具有高毒力的阪崎克羅諾桿菌占顯著優(yōu)勢，對成人具有感染力的丙二酸鹽克羅諾桿菌所占比例次之，另一個對人類有感染力的蘇黎世克羅諾桿菌則未檢出。說明這些食品，尤其是嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的危害不可小視。

克羅諾桿菌對四環(huán)素、氨基糖苷類抗生素、多種β-內(nèi)酰胺類抗生素、氯霉素和喹諾酮敏感，所以臨床治療其感染多選用氨芐青霉素-慶大霉素或氨芐青霉素-鏈霉素[22]，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些氨芐青霉素或慶大霉素抗性菌株出現(xiàn)，這是因為它們獲得了某些轉(zhuǎn)座子，或產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的能力和多重耐藥基因簇。本實驗分離到的38 株分離株中未發(fā)現(xiàn)對這2 種抗生素組合的雙重耐藥譜。

特別值得注意的是很多文獻認為克羅諾桿菌對萬古霉素抗性可達100%[1,23]，所以在GB 4789.40—2010中所用的富集培養(yǎng)基中含10 μg/mL的萬古霉素。依據(jù)GB 4789.40—2010進行前期分離和初步鑒定，也就是說本實驗中分離株至少能耐受10 μg/mL的萬古霉素，但是藥敏實驗中用了30 μg/mL的萬古霉素，有1 株敏感菌，2 株中介菌。周顯鳳等[16]也曾發(fā)現(xiàn)1 株嬰幼兒配方奶粉的阪崎腸桿菌分離株對30 μg/mL的萬古霉素敏感。這促使本課題組考慮有沒有更敏感的菌株存在；目前采用的選擇型培養(yǎng)基有可能導致萬古霉素敏感菌株漏檢。

2012年Lee等[24]分析了353 份來自韓國的食品中分離到的66 株克羅諾桿菌，并進行了生物膜和耐藥性實驗：其中占顯著優(yōu)勢的阪崎克羅諾桿菌有58 株（87.9%），剩下的分別為2 株莫金斯克羅諾桿菌和6 株都柏林克羅諾桿菌。Lee等[24]研究的韓國株和本實驗分離株（武漢株、云南株、丹麥奧胡斯大學的5 個標準株，下同）均對氯霉素和氨芐青霉素高度敏感，但是在四環(huán)素和氨基糖苷類抗生素的敏感率差異非常顯著。韓國分離株對四環(huán)素敏感率達98.2%，而本實驗分離株僅為14.0%；本實驗中選用了氨基糖苷類抗生素中的慶大霉素、奈替米星和卡那霉素，敏感率分別為97.7%、97.7%和74.4%；而韓國選用了鏈霉素，敏感率僅為12.0%，中介率高達75.9%。即使是我國不同地區(qū)，比如武漢地區(qū)分離株和云南地區(qū)分離株對11 種抗生素的敏感性也有一定差異。反映出不同國家、地區(qū)在食品行業(yè)的上游比如：農(nóng)業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)抗生素的施用種類和環(huán)境中殘留濃度有顯著差異。

菌株的生物膜形成能力測試實驗容易受到多種因素的影響干擾，需要標準株參照。本實驗和Lee等[24]都采用了克羅諾桿菌ATCC29544T作為標準株，且兩者測定的數(shù)值有可比性（（0.33±0.06）/（0.29±0.02））。Lee等[24]以OD600nm＞1.0為能力強，0.5＜OD600nm＜1.0為中等，OD600nm＜0.5為弱，發(fā)現(xiàn)13.8%的阪崎克羅諾桿菌生物膜形成能力強，19.0%為中等；而2 株莫金斯克羅諾桿菌和6 株都柏林克羅諾生物膜形成能力弱。同樣標準，本實驗中的34 株阪崎克羅諾桿菌僅有2 株為中等，其余生物膜形成能力都為弱；反而是7 株丙二酸鹽克羅諾桿菌有3 株達到中等，2 株都柏林克羅諾桿菌最弱（0.23～0.24）。

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Biofilm Detection and Antibiotic Sensitivity Analysis of Cronobacter

ZHANG Yi1, CHEN Yaheng1, ZHOU Guoping1,*, YANG Zushun2
(1. School of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Center for Disease Control and Prevention of Yunnan Province, Kunming 650022, China)

Cronobacter isolates including 5 standard strains and 38 isolates from infant foods were studied for biofil-formating capability and antibiotic sensitivity. The fusA sequence analysis was used to identify the species of these isolates. Then the isolates were tested for biofilm-forming capability by crystal violet staining. And 11 antibiotics belonging to 8 categories were selected to test their antibiotic sensitivity. Totally 34 C. sakazakii, seven C. malonaticus and two C. dublinensis strains were identified. All these isolates were able to form biofilm. C. malonaticus showed stronger biofilm-forming capability. The resistance to tetracycline and vancomycin was higher. Totally 14 antibiotic resistance homologies were identified. The resistance to tetracycline correlated with biofilm-forming capability. All the Cronobacter isolates investigated showed biofilm-forming capability and antibiotic resistance to some extent, which pose a challenge the disinfection and sterilization methods used in food industries and clinical therapy.

Cronobacter; identification; biofilm; antibiotic susceptibility

Q939.97

A

1002-6630（2015）21-0129-06

10.7506/spkx1002-6630-201521025

2014-11-30

中國-丹麥政府間科技合作項目（[2010]329）；湖北省教育廳科學研究計劃資助項目（Q20111703）；

武漢輕工大學研究生創(chuàng)新基金項目（2013cx020）

張翼（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食源性微生物檢測與分析。E-mail：757631504@qq.com

*通信作者：周幗萍（1971—），女，副教授，博士，研究方向為微生物發(fā)酵與食品安全。E-mail：wjczgp@163.com