王之珺，張柳婧，鐘瑩霞，闞麗嬌，謝建華，謝明勇

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

青錢柳多糖的乙?；揎椉翱寡趸钚?/p>

王之珺，張柳婧，鐘瑩霞，闞麗嬌，謝建華*，謝明勇

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

以青錢柳多糖為原料，使用乙酸酐法制備得到乙酰化青錢柳多糖樣品。以乙酰化多糖取代度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察乙酸酐-多糖比例、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)乙?；揎椀挠绊?。在此基礎(chǔ)上，選擇取代度為0.681的乙?；嗵菢悠愤M(jìn)行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，青錢柳多糖乙酰化最優(yōu)反應(yīng)條件為：m（多糖）∶V（乙酸酐）＝1∶60、反應(yīng)時(shí)間2 h、反應(yīng)溫度40 ℃，同時(shí)，乙?；揎椏梢燥@著提高青錢柳多糖的DPPH自由基清除活性，乙?；揎椏勺鳛榍噱X柳多糖改性的方法之一，為青錢柳資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供新的方向。

青錢柳；多糖；乙酰化修飾；抗氧化

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja）是我國特有的胡桃科青錢柳屬植物，又被稱為青錢李、搖錢樹。青錢柳的活性成分主要包括：多糖、黃酮、氨基酸和三萜類化合物等[1]。青錢柳多糖是提取自青錢柳葉片中的一種雜多糖，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖等單糖組成[2]，并具有抗氧化[3]、降血糖[4]、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤[5]等多種生物活性。由于其出色的保健效果，目前青錢柳已被開發(fā)成多種功能性茶飲料。

多糖是一類由10 個(gè)以上單糖聚合而成的大分子物質(zhì)，又被稱作多聚糖[6]。近年來，隨著乙酰基與活性多糖構(gòu)效關(guān)系的研究不斷深入，乙?；揎椫饾u成為一種對(duì)多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的有效方法。許多研究表明經(jīng)乙?；揎椇蟮亩嗵?，其抗氧化[7]和免疫調(diào)節(jié)活性[8]可以得到顯著提高。本實(shí)驗(yàn)以江西修水青錢柳為原料，利用水提醇沉法提取、Sevag法脫蛋白以得到精制多糖，使用乙酸酐法對(duì)多糖進(jìn)行乙?；揎?，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化青錢柳多糖乙?；淖顑?yōu)條件，并利用有機(jī)自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH））體系評(píng)價(jià)乙?；揎棇?duì)多糖體外抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳，由江西神茶實(shí)業(yè)有限公司提供。

DPPH 美國Sigma公司；抗壞血酸 美國Aladdin試劑有限公司；無水乙醇、乙酸酐 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、濃鹽酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；ALPHA1-2冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；SHZ-82A恒溫水浴搖床 常州恒隆儀器有限公司；EYELA N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社；TGL-5-A離心機(jī) 上海飛鴿系列離心機(jī)廠；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PB-10 pH計(jì) 德國Sartorius 公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；AL-104 型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 青錢柳精制多糖的制備

采用熱水浸提法提取青錢柳多糖[9]。稱取800 g干燥的青錢柳葉片粉末，按照1∶10（m/V）加入8 000 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，浸泡過夜，除去脂質(zhì)、單糖、色素等小分子物質(zhì)。過濾后，揮干乙醇，收集殘?jiān)?，在料液?∶8（m/V）的條件下，將青錢柳置于80 ℃水浴浸提120 min。浸提后過濾，收集濾液，濾渣繼續(xù)水浴浸提。反復(fù)對(duì)濾渣進(jìn)行兩次浸提后合并所有濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮后保存?zhèn)溆?。采用Sevag法進(jìn)行脫蛋白，按照V（正丁醇）∶V（三氯甲烷）=1∶5的比例配制Sevag試劑，以濃縮液體積的1/5加入Sevag試劑，并持續(xù)振蕩10 min使?jié)饪s液與Sevag試劑充分接觸，再將混合液放入離心機(jī)中離心10 min，反復(fù)多次至無蛋白沉淀。合并上清液，真空旋蒸以除去有機(jī)溶劑，然后將其轉(zhuǎn)入截留分子質(zhì)量8 000～14 000 u透析袋中，依次使用自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，超純水透析24 h。透析后，經(jīng)濃縮、醇沉、冷凍干燥，即得到精制的青錢柳多糖樣品（CP），干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 優(yōu)化條件的選擇

本課題組前期研究結(jié)果表明，m（多糖）∶V（乙酸酐）、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度是3 個(gè)影響乙?；嗵侨〈鹊闹饕蛩豙10]。為進(jìn)一步研究乙?；揎椙噱X柳多糖的最佳工藝條件，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以及Han Fei[11]、梁少茹[12]和宋逍[13]等多糖乙酰化工藝優(yōu)化的結(jié)果，選取反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及m（多糖）∶V（乙酸酐）進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，其中試驗(yàn)號(hào)1～9分別對(duì)應(yīng)乙?；噱X柳多糖樣品Ac-CP1～Ac-CP9。

1.3.3 乙?；噱X柳多糖的制備

采用乙酸酐法[10,14]制備乙酰化青錢柳多糖，并使用正交試驗(yàn)法[11]考察m（多糖）∶V（乙酸酐）、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)乙?；嗵侨〈鹊挠绊?。稱取一定質(zhì)量的青錢柳多糖分別用10 mL超純水溶于20 mL的試管中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，分兩次加入2 mL的乙酸酐后，磁力攪拌15 min，調(diào)節(jié)pH值到8.0。之后將配制好的反應(yīng)液放入恒溫水浴搖床中分別反應(yīng)1、2、3 h。在40、60、80℃水浴下分別制得乙酰化青錢柳多糖（Ac-CP）。

反應(yīng)結(jié)束后，離心，收集上清液，轉(zhuǎn)入8 000～14 000 u透析袋中，依次使用自來水、蒸餾水、超純水均分別透析24 h。透析后，將反應(yīng)液進(jìn)行濃縮，以V（反應(yīng)液）∶V（無水乙醇）=1∶4的比例對(duì)所有反應(yīng)液進(jìn)行醇沉。4 ℃醇沉過夜后，離心，沉淀加水復(fù)溶。除去乙醇后，經(jīng)冷凍干燥即得乙酰化青錢柳多糖，分別命名為：Ac-CP1～Ac-CP9。

1.3.4 乙?；〈龋╠egree of substitution，DS）的測(cè)定

采用中和滴定法測(cè)定DS[11]。取9 支20 mL的試管，分別稱取10 mg乙?；噱X柳多糖加入試管中。再加入10 mL 0.01 mol/L的NaOH溶液溶解乙?；噱X柳多糖，將試管放入水浴恒溫振蕩器中，在50 ℃條件下劇烈振蕩2 h。待反應(yīng)結(jié)束之后，用0.012 mol/L的HCl溶液反滴定至pH值為7.0。取代度計(jì)算公式如下。

式中：A為乙?；?%；V0為加入NaOH溶液的體積/mL；c0為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；V1為反滴定時(shí)消耗HCl溶液的體積/mL；c1為HCl溶液的濃度/（mol/L）；m為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.5 乙?；噱X柳多糖的自由基清除活性的測(cè)定

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，選用乙?；嗵茿c-CP4（DS=0.681）參照文獻(xiàn)[15]方法，測(cè)定乙?；揎棇?duì)青錢柳多糖抗氧化活性的影響。準(zhǔn)確稱取25 mg乙?；嗵菢悠芳拔葱揎椀那噱X柳多糖分別定容至25 mL，配制成1 mg/mL溶液，分別稀釋至31.25、62.5、125、250、500 μg/mL。將實(shí)驗(yàn)分為樣品組、對(duì)照組和空白組，以抗壞血酸為陽性對(duì)照。2 mL 1 mmol/L的DPPH溶液加入10 mL具塞試管中，再加入0.5 mL樣品溶液，然后再加入1.5 mL水充分混勻，靜置30 min后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

式中：A2為2 mL DPPH溶液+0.5 mL多糖樣品溶液+ 0.5 mL水的吸光度；A1為2 mL乙醇+0.5 mL多糖樣品溶液+0.5 mL水的吸光度；A0為2 mL DPPH溶液+2 mL水的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化乙酰化青錢柳多糖的制備

表1 乙?；噱X柳多糖制備的正交試驗(yàn)優(yōu)化方案及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimal preparation of acetylated C. paliurus polysaccharides

由表1可知，取代度最高的是Ac-CP4和Ac-CP5，其取代度為0.681；取代度最低的是Ac-CP8，其取代度為0.379，兩者之間多糖取代度相差0.302。反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)或過短時(shí)，多糖取代度都呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，最佳反應(yīng)時(shí)間為2 h；反應(yīng)溫度為40 ℃或80 ℃時(shí)的多糖取代度比較相近，均高于60 ℃，在本實(shí)驗(yàn)中，最佳反應(yīng)溫度為40 ℃；m（多糖）∶V（乙酸酐）越高時(shí)，多糖取代度越高。根據(jù)K值直觀分析，最佳乙?；に嚄l件是：A2B1C3，即反應(yīng)時(shí)間為2 h、反應(yīng)溫度為40 ℃、m（多糖）：V（乙酸酐）為1∶60。在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得乙?；嗵瞧骄〈扰c理論預(yù)測(cè)值比較誤差小于3%，結(jié)果較為理想。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

以取代度為指標(biāo)，根據(jù)取代度結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表2可知，影響青錢柳多糖乙?；闹饕蛩厥莔（多糖）∶V（乙酸酐）和反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度對(duì)多糖乙?；挠绊懴鄬?duì)較小，各因素對(duì)取代度影響程度依次為C＞A＞B，即依次是m（多糖）∶V（乙酸酐）、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度。

2.2 乙?；揎棇?duì)青錢柳多糖體外抗氧化活性的影響

機(jī)體在新陳代謝過程中會(huì)產(chǎn)生包括有機(jī)自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基等多種自由基[16]，當(dāng)自由基在體內(nèi)積累到一定濃度時(shí)，便會(huì)對(duì)機(jī)體細(xì)胞正常的生命活動(dòng)造成侵害[17]?，F(xiàn)代社會(huì)，諸如糖尿病、心血管疾病、高血壓等許多困擾人們身心健康的疾病都與自由基的活動(dòng)有關(guān)[18-19]。許多研究用DPPH自由基清除能力作為天然活性成分抗氧化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)[20-21]。

圖1 乙酰化青錢柳多糖Ac-CP4對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activity of acetylated polysaccharide Ac-CP4

由圖1可知，修飾后與未修飾的青錢柳多糖DPPH自由基清除率均隨質(zhì)量濃度的增加而增加，呈一定的劑量依賴關(guān)系，在500 μg/mL時(shí)其清除率達(dá)到最高，接近85%，之后增幅趨于平緩。有研究證實(shí)，較高的取代度可賦予修飾后多糖更強(qiáng)的生物活性[14]，因此根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇取代度最高的Ac-CP4樣品進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，可以觀察到Ac-CP4清除率與樣品質(zhì)量濃度成顯著的正相關(guān)，并且在較高質(zhì)量濃度如500 μg/mL和1 000 μg/mL時(shí)，乙?；嗵荄PPH自由基清除率分別增加至（91.69±0.51）% 和（93.07±1.28）%，明顯高于未經(jīng)修飾的同質(zhì)量濃度青錢柳多糖的清除率（84.42±1.03）%及（86.15±1.73）%（P＜0.05），說明乙酰化修飾可起到增強(qiáng)青錢柳多糖清除DPPH自由基能力的作用。另外，VC作為陽性對(duì)照組，顯示出較強(qiáng)的抗氧化性，證明DPPH自由基體系建立成功，可以借助其清除率評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的活性強(qiáng)弱。

隨著結(jié)構(gòu)修飾逐漸成為多糖構(gòu)效關(guān)系的研究熱點(diǎn)，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)表明，合理的結(jié)構(gòu)修飾可以增強(qiáng)包括抗氧化、免疫活性、抗凝血在內(nèi)的多種生物活性[22-23]。經(jīng)乙酰化修飾后的南瓜多糖，其DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除率均可得到顯著增強(qiáng)，并且與乙?；〈瘸烧嚓P(guān)[14]。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與Zhang Zhongshan等[24]對(duì)乙?；喜司厶堑难芯拷Y(jié)果類似。多糖構(gòu)效關(guān)系研究表明，多糖的抗氧化活性可能來自于其糖環(huán)上的游離羥基、酚類物質(zhì)和交聯(lián)蛋白的共同作用[25]，這也進(jìn)一步說明多糖的抗氧化機(jī)理比較復(fù)雜，可能與其結(jié)合組分種類、高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，多糖經(jīng)乙酰化修飾后，其空間構(gòu)象發(fā)生變化，使其更易于提供羥基，從而有利于捕捉自由基，提高抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用乙酸酐法對(duì)青錢柳多糖進(jìn)行乙酰化修飾，并使用正交試驗(yàn)得到了最優(yōu)的乙酰化條件，即反應(yīng)時(shí)間2 h、反應(yīng)溫度40 ℃、m（多糖）∶V（乙酸酐）為1∶60。進(jìn)一步在體外進(jìn)行的DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)乙?；揎椇蟮那噱X柳多糖，其對(duì)DPPH自由基的清除能力得到顯著提高，乙?；揎椏梢蕴岣叨嗵堑目寡趸钚?。本研究表明乙酰化修飾可用于青錢柳多糖的結(jié)構(gòu)改性，為其構(gòu)效關(guān)系研究提供新的方向。

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Acetylated Modification and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Cyclocarya paliurus

WANG Zhijun, ZHANG Liujing, ZHONG Yingxia, KAN Lijiao, XIE Jianhua*, XIE Mingyong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Acetylated polysaccharides from Cyclocarya paliurus were prepared by using acetic anhydride method. An orthogonal array design was used to investigate the effects of ratio between acetic anhydride and polysaccharids, reaction temperature and reaction time on the efficiency of acetylated modification as evaluated by degree of substitution (DS). The antioxidant activity of acetylated polysaccharide (DS = 0.681) was investigated by DPPH radical scavenging capacity. The optimal conditions for acetylated modification were determined as 1:60, 2 h and 40 ℃ for ratio between acetic anhydride and polysaccharids, reaction time and reaction temperature, respectively. The results indicated that acetylated modification could enhance the antioxidant activity of Cyclocarya paliurus polysaccharides significantly. In conclusion, acetylation could be considered as an efficient method for the modification of Cyclocarya paliurus polysaccharides which provides a new direction for the development and utilization of Cyclocarya paliurus.

Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja; polysaccharides; acetylation; antioxidation

TQ281

A

1002-6630（2015）21-0006-04

10.7506/spkx1002-6630-201521002

2015-06-25

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471702）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201297）

王之珺（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析。E-mail：zjwang0916@163.com

*通信作者：謝建華（1982—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称诽妓衔锝Y(jié)構(gòu)與功能。E-mail：jhxie@ncu.edu.cn