趙雪強(qiáng)，蔣碧佳，銀建華，唐碧蕓，黃秀蘭，李文翠

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨桂分院/臨桂縣人民醫(yī)院，廣西桂林541199）

ATO聯(lián)合TRAIL對(duì)肺癌裸鼠移植瘤抑制作用及機(jī)制研究

趙雪強(qiáng)，蔣碧佳，銀建華，唐碧蕓，黃秀蘭，李文翠

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨桂分院/臨桂縣人民醫(yī)院，廣西桂林541199）

目的探討腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）聯(lián)合三氧化二砷（ATO）對(duì)裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用及其可能機(jī)制。方法將裸鼠肺癌移植瘤模型隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、TRAIL組、ATO低劑量組（ATO1組）、ATO高劑量組（ATO2組）、TRAIL聯(lián)合ATO組，稱取瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率，采用免疫組化法檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表達(dá)。結(jié)果與陰性對(duì)照組比較，ATO1組、ATO2組對(duì)裸鼠肺癌移植瘤均具有抑制作用，TRAIL聯(lián)合ATO組具有協(xié)同增效作用，并且上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論ATO能增強(qiáng)TRAIL對(duì)裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

肺腫瘤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；三氧化二砷；腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand，TRAIL）是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族新成員，具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)機(jī)體正常組織不具有明顯的不良反應(yīng)[1]。但最近研究表明，大部分肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥，TRAIL的耐藥機(jī)制目前仍不十分清楚[2]。在體外發(fā)現(xiàn)三氧化二砷（arsenic trioxdio，ATO）不但可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，還可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性[3]。但鑒于體外肺癌細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)肺癌微環(huán)境的差異，本研究通過建立肺癌裸鼠移植瘤模型，采用TRAIL、ATO單藥及聯(lián)合用藥對(duì)肺癌移植瘤的生物作用及可能機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為肺癌的臨床治療提供新的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料人肺腺癌A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自存。BALB/ c-nu裸鼠25只，雄性，6～8周，體質(zhì)量16～24 g，購自桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物室。杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）購自GIBICO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，ATO購自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司，TRAIL購自以色列PROSPEC公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）一抗、二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，在恒溫37℃、5%二氧化碳飽和濕度下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后用培養(yǎng)基終止消化，然后，用磷酸鹽緩沖液洗滌、離心、去上清液，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108mL-1的細(xì)胞懸液備用（臺(tái)盼藍(lán)染色確定所用細(xì)胞活力在95%以上）。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型建立及實(shí)驗(yàn)分組在恒溫（26～28℃）、恒濕（40%～60%）的無特定病源的（specificpathogen free，SPF）層流環(huán)境中飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)裸鼠。裸鼠食用的飼料及飲用水均經(jīng)高壓、高溫滅菌。取上述細(xì)胞懸液接種于裸鼠右前腋窩部皮下，每只注射0.2 mL，接種后每天觀察皮下移植瘤生長情況及接種點(diǎn)有無紅腫、出血，接種后5 d開始成瘤，21 d左右明顯成瘤，移植瘤模型建立。隨機(jī)選擇其中荷瘤成功的裸鼠20只，隨機(jī)分為五組，每組4只。（1）陰性對(duì)照組：僅給予0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（2）TRAIL組：以50 μg/kg劑量腹腔注射給藥，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（3）ATO低劑量組（ATO1組）：以1.5 mg/kg劑量腹腔注射給藥，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（4）ATO高劑量組（ATO2組）：以3.0 mg/kg劑量腹腔注射給藥，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（5）ATO聯(lián)合TRAIL組：ATO以1.5 mg/kg劑量、TRAIL以50 μg/kg劑量腹腔注射給藥，各取0.2mL，每2天注射1次，共注射8次。

1.2.3 測(cè)量藥物作用后移植瘤質(zhì)量及抑瘤率首次用藥后第15天斷頸處死全部裸鼠，手術(shù)完整取出腫瘤組織，剔除其他組織，稱移植瘤質(zhì)量。按公式計(jì)算腫瘤抑制率（%）=（1-干預(yù)組平均瘤質(zhì)量/陰性對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%。

1.2.4 病理組織學(xué)觀察及免疫組化檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)用4%多聚甲醛固定取出的移植瘤標(biāo)本，石蠟包埋連續(xù)切片，切片用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin eosin，HE），顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)改變并拍照。將石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察腫瘤細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。嚴(yán)格按照試劑盒提供的檢測(cè)步驟進(jìn)行操作，結(jié)果判定：以細(xì)胞質(zhì)染為棕色至棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)記。每組隨機(jī)選3個(gè)切片標(biāo)本，顯微鏡下觀察每張切片，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，分析陽性細(xì)胞光密度（optical density，OD）值，并計(jì)算各組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；抑瘤率以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠生長狀況腫瘤細(xì)胞接種后裸鼠皮下移植瘤生長良好，21 d左右移植瘤直徑平均達(dá)5 mm，成瘤率為100.00%。藥物干預(yù)前裸鼠一般狀態(tài)好；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)20只裸鼠無一例死亡。經(jīng)過每天密切觀察發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組和TRAIL組裸鼠活動(dòng)、進(jìn)食明顯減少，對(duì)外界反應(yīng)遲緩；ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組祼鼠無明顯驚恐、不安及拒食，均未發(fā)現(xiàn)排便異常、接種部位皮膚壞死等。

2.2 裸鼠體質(zhì)量變化各組藥物干預(yù)前裸鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù)后ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組裸鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。陰性對(duì)照組及TRAIL組較ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組裸鼠體質(zhì)量明顯減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 裸鼠移植瘤質(zhì)量及抑瘤率觀察藥物干預(yù)后ATO1組、ATO2組、TRAIL聯(lián)合ATO組裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量較陰性對(duì)照組、TRAIL組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），TRAIL聯(lián)合ATO組更為明顯，抑瘤率為80.60%，見表2。

表1 各組裸鼠藥物干預(yù)前后體質(zhì)量比較（±s，g）

表1 各組裸鼠藥物干預(yù)前后體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與陰性對(duì)照組、TRAIL組干預(yù)后比較，aP＜0.05。

組別陰性對(duì)照組TRAIL組ATO1組ATO2組TRAIL聯(lián)合ATO組n干預(yù)前干預(yù)后44444 17.72±1.15 19.39±2.13 18.92±1.77 18.47±1.52 18.98±2.42 16.00±1.66 17.61±1.44 20.02±2.17a19.18±2.21a20.09±2.56a

表2 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

2.4 移植瘤HE染色光鏡觀察TRAIL組移植瘤內(nèi)腫瘤組織形態(tài)學(xué)無顯著變化，隨著ATO藥物劑量的增加，肺癌組織減少，肺癌細(xì)胞數(shù)量也隨之減少，并失去肺腺癌細(xì)胞的腺腔樣結(jié)構(gòu)的典型特征，且腫瘤組織出血、壞死增多，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核固縮變小，甚至核溶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，呈現(xiàn)空泡化改變；而ATO聯(lián)合TRAIL組較ATO1組、ATO2組更為明顯，見圖1。

圖1 腫瘤組織學(xué)檢查（HE染色，400×）

2.5 移植瘤組織內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)情況與陰性對(duì)照組比較，TRAIL組Caspase-3表達(dá)無明顯改變，隨著ATO藥物劑量的增加，Caspase-3表達(dá)陽性率增加，ATO聯(lián)合TRAIL組明顯上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，與其他組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 Caspase-3蛋白的表達(dá)（免疫組化，400×）

2.6 Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞OD值陰性對(duì)照組、TRAIL組、ATO1組、ATO2組，TRAIL聯(lián)合ATO組Caspase-3蛋白陽性細(xì)胞OD值分別為0.204±0.014、0.225± 0.008、0.415±0.014、0.666±0.014和0.705±0.013。

3 討論

TRAIL是近年來發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，通過與其細(xì)胞表面受體[死亡受體4（death receptor 4，DR4）、死亡受體5（death receptor 5，DR5）]特異性結(jié)合從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并且對(duì)機(jī)體正常組織無明顯不良反應(yīng)[1]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，大部分肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥，限制了TRAIL的臨床應(yīng)用[2，4-5]。TRAIL與ATO聯(lián)用在體外克服肺癌耐藥方面有效[3]。

有研究已發(fā)現(xiàn)，ATO具有抗腫瘤作用，但其作用是多途徑、多靶點(diǎn)的復(fù)雜過程[6]。很多學(xué)者認(rèn)為，ATO的主要抗腫瘤機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[7-8]。ATO是通過降解融合蛋白、改變線粒體跨膜電位、通過轉(zhuǎn)錄因子影響細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換、影響凋亡相關(guān)基因（如Caspase因子）等方法，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9-10]。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道，增加ATO劑量可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥性[11]，但隨著ATO劑量的增加，對(duì)正常細(xì)胞的不良反應(yīng)也增大，從而影響了ATO在治療肺癌方面的臨床應(yīng)用。目前，以ATO為基礎(chǔ)的化療組合成為研究熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATO具有抗肺癌移植瘤的作用，并使肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，甚至使肺癌組織發(fā)生壞死，增加ATO劑量可上調(diào)細(xì)胞質(zhì)中Caspase-3的表達(dá)。TRAIL組瘤質(zhì)量及抑瘤率與陰性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥。TRAIL聯(lián)合ATO組明顯抑制裸鼠肺癌移植瘤生長，通過HE染色鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，ATO可增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡主要是通過細(xì)胞內(nèi)的線粒體通路和細(xì)胞外的DR通路啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。線粒體通路主要是通過細(xì)胞內(nèi)的促凋亡因子和抗凋亡因子相互作用調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促凋亡因子（如B細(xì)胞淋巴瘤-白血病2蛋白家族成員）可使線粒體膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C（cytocrhome C，Cyt-C）[12]，Cyt-C與凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic proteaseactivating factor，Apaf-1）結(jié)合形成復(fù)合體并激活Caspase-9，解除凋亡抑制因子對(duì)Caspase-3的阻礙作用，激活Caspase-3發(fā)生生物效應(yīng)，最終引起腫瘤細(xì)胞凋亡[13]；DR通路主要是當(dāng)DR與死亡配體結(jié)合后傳遞凋亡信號(hào)，引起胞內(nèi)Caspase-8的前體Procaspase在其末端的局部募集和串聯(lián)結(jié)合，從而形成凋亡酶體（apoptosome），凋亡酶體形成后，其分子中的Procaspase通過自身水解而成為有活性的Caspase-8，活化的Caspase-8可引發(fā)下游的Caspase蛋白酶裂解多種蛋白質(zhì)，如Caspase-3，然后激活下游效應(yīng)酶，最終誘導(dǎo)大量腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。而作為這2條凋亡通路上的下游共同基因——Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中具有至關(guān)重要的作用。所以，增加Caspase-3的表達(dá)就意味著可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡程序。本研究發(fā)現(xiàn)，增加ATO藥物劑量Caspase-3的表達(dá)也相應(yīng)增加，TRAIL聯(lián)合ATO組明顯上調(diào)Caspase-3的表達(dá)。因此，ATO可增強(qiáng)TRAIL對(duì)裸鼠肺癌移植瘤的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，TRAIL聯(lián)合ATO可通過上調(diào)Caspase-3表達(dá)，提高肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，從而具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長的作用，為TRAIL和ATO二者配伍應(yīng)用于臨床提供了進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

[1]Zhao J，Lu Y，Shen HM.Targeting p53 as a therapeutic strategy in sensitizing TRAIL-induced apoptosis in cancer cells[J].Cancer Lett，2012，314（1）：8-23.

[2]Stegehuis JH，de Wilt LH，de Vries EG，et al.TRAIL receptor targeting therapies for non-small cell lung cancer：Current status and perspectives[J]. Drug Resist Updat，2010，13（1/2）：2-15.

[3]王績英，趙雪強(qiáng)，王昌明，等.三氧化二砷通過抑制NF-κB增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，43（6）：834-838.

[4]Lu T，Shao N，Ji C.Targeting microRNAs to modulate TRAIL-induced apoptosis of cancer cells[J].Cancer Gene Ther，2013，20（1）：33-37.

[5]Wang F，Lin J，Xu R.The Molecular Mechanisms of TRAIL Resistance in Cancer Cells：Help in Designing New Drugs[J].Curr Pharm Des，2014，20（42）：6714-6722.

[6]Chen SJ，Zhou GB，Zhang XW，et al.From an old remedy to a magic bullet：molecular mechanisms underlying the therapeutic effects of arsenic in fighting leukemia[J].Blood，2011，117（4）：6425-6437.

[7]Yu Q，Chen B，Zhang X，et al.Arsenic trioxide-enhanced，matrine-induced apoptosis in multiple myeloma cell lines[J].Planta Med，2013，79（9）：775-781.

[8]Kerl K，Moreno N，Holsten T，et al.Arsenic trioxide inhibits tumor cell growth in malignant rhabdoid tumors in vitro and in vivo by targeting overexpressed Gli1[J].Int J Cancer，2014，135（4）：989-995.

[9]王長安，鄧述愷.三氧化二砷抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2011，24（5）：458-460.

[10]Han B，Zhou G，Zhang Q，et al.Effect of arsenic trioxide（ATO）on human lung carcinoma PG cell line：ATO induced apoptosis of PG cells and decreased expression of Bcl-2，Pgp[J].J Exp Ther oncol，2004，4（4）：335-342.

[11]吳廣洲，沈振亞，劉國鋒，等.三氧化二砷對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP裸鼠體內(nèi)的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，31（1）：79-83.

[12]Akl H，Vervloessem T，Kiviluoto S，et al.A dual role for the anti-apoptotic Bcl-2 protein in cancer：mitochondria versus endoplasmic reticulum[J]. Biochim Biophys Acta，2014，1843（10）：2240-2252.

[13]Miramar MD，Costantini P，Ravagnan L，et al.NADH oxidaseactivity of mitochondrial apoptosis-inducing factor[J].J Biol Chem，2001，276（19）：16391-16398.

[14]Yamada H，Tada-Oikawa S，Uchida A，et al.TRAIL causes cleavage of bid by caspase-8 and loss of mitochondrial membrane potential resulting in apoptosis in BJAB cells[J].Biochem Biophys Res Commun，1999，265（1）：130-133.

Study on inhibitory action and mechanism of arsenic trioxide combined with TRAIL on transplanted human lung cancer in nude mice

Zhao Xueqiang，Jiang Bijia，Yin Jianhua，Tang Biyun，Huang Xiulan，Li Wencui
（The Lingui Branch of Affiliated Hospital of Guilin Medical College/Lingui County People′s Hospital，Guilin，Guangxi 541199，China）

ObjectiveTo approach the inhibitory action and proposed mechanism of TRAIL combined with ATO on transplanted human lung cancer in nude mice.MethodsThe nude mice bearing A549 lung cancer samples were randomly divided into the negative control group，group TRAIL，group ATO1，group ATO2 and TRAIL+ATO group.Tumor tissues were weighted and the inhibitory rate was observed.Immunohistochemistry was applied to detect the expression of Caspase-3 after treatments.ResultsCompared with the negative control group，it had a strong the obviously action inhibition on transplanted human lung cancer of nude mice in group ATO1 and group ATO2 while a synergistic effect in group TRAIL+ATO，and increased the expression of Caspase-3，whose difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionATO may inhibit the growth of transplanted human lung cancer in nude mice through strengthening TRAIL，whose possible mechanism is potentially related to the expression of Caspase-3.

Lung Neoplasms；Caspase 3；Arsenic trioxide；Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.04.002

：A

：1009-5519（2015）04-0485-03

2014-08-14

2014-09-25）

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳立項(xiàng)課題（Z2013490）。

趙雪強(qiáng)（1981-），男，廣西桂林人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事肺癌基礎(chǔ)與臨床研究；E-mail：myzhaoxueqiang@126.com。