王立朋 鮑翠霞 于麗梅 張曉錄 于威娟 張霞 李瑋 黃葆華 李杰 孫成銘（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院檢驗(yàn)科，煙臺(tái)264000）

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核酸序列依賴性擴(kuò)增、Real?time PCR及GM試驗(yàn)診斷侵襲性曲霉菌感染的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

王立朋 鮑翠霞 于麗梅 張曉錄 于威娟 張霞 李瑋 黃葆華 李杰 孫成銘
（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院檢驗(yàn)科，煙臺(tái)264000）

【摘要】目的 核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleic acid sequence?based amplification，NASBA）、Real?time PCR及GM試驗(yàn)在侵襲性曲霉菌感染中的診斷價(jià)值。方法 收集2013年11月～2014年6月臨床上曲霉菌感染高危病患的血液標(biāo)本80例，并根據(jù)EORTC／MSG診斷標(biāo)準(zhǔn)分為確診組8例，擬診組26例，非感染組46例，分別利用NASBA、real?time PCR及GM試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算3種方法的診斷指標(biāo)并分析評(píng)價(jià)。結(jié)果 NASBA、real?time PCR及GM試驗(yàn)3種方法的靈敏度分別為76．47%、67．65%、52．94%，特異度分別為80．43%、89．13%、80．43%。聯(lián)合診斷結(jié)果顯示，NASBA與real?time PCR串聯(lián)方案有最好的特異度（100%）及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（100%）；NASBA與real?time PCR并聯(lián)方案則最為靈敏（94．12%）。結(jié)論 NASBA用于診斷IA最為敏感，而real?time PCR則最為特異，GM試驗(yàn)的表現(xiàn)差于前兩者。聯(lián)合應(yīng)用的診斷策略，在特定情況下提高臨床早期診斷IA的準(zhǔn)確性。

【關(guān)鍵詞】侵襲性曲霉菌感染；核酸序列依賴性擴(kuò)增；實(shí)時(shí)PCR；GM試驗(yàn)

[Chin J Mycol，2015，10（5）：283?287]

侵襲性曲霉菌感染（IA）是一種機(jī)會(huì)性真菌感染，過(guò)去的20 a里，由于腫瘤化療，造血干細(xì)胞及實(shí)體器官移植術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物，臨床上出現(xiàn)越來(lái)越多的免疫力低下的患者，使得IA的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，死亡率也一直居高不下[1?2]。早期準(zhǔn)確的診斷結(jié)果是及早開(kāi)展抗曲霉菌治療、改善臨床預(yù)后的關(guān)鍵。盡管傳統(tǒng)方法與血清學(xué)檢測(cè)及影像學(xué)檢查相結(jié)合的診斷策略已經(jīng)取得了巨大進(jìn)步，但是這些診斷方法目前均不能使臨床醫(yī)師滿意。

分子生物學(xué)的方法在一系列感染性疾病，包括曲霉菌感染的診斷中展現(xiàn)出良好的前景。核酸序列依賴性擴(kuò)增（NASBA）是一種特異性地等溫?cái)U(kuò)增RNA的技術(shù)。相比較而言，傳統(tǒng)的PCR技術(shù)每次循環(huán)只產(chǎn)生雙倍的復(fù)制子，而NASBA每次擴(kuò)增可產(chǎn)生10～100倍的RNA分子，且可在30 min產(chǎn)生多達(dá)1012個(gè)復(fù)制子，擴(kuò)增效率明顯高于普通PCR[3]。目前NASBA技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)菌和病毒的感染[4?5]。本研究收集臨床上曲霉菌感染的高危病患的血液標(biāo)本，以血液中游離曲霉菌RNA、DNA、半乳甘露聚糖（GM）為靶標(biāo)，分別利用NASBA、real?time PCR及GM試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算3種方法的診斷指標(biāo)并分析評(píng)價(jià)，以確立可行性較高的侵襲性曲霉菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷策略。

1　 材料和方法

1．1 研究對(duì)象

收集2013年11月～2014年6月臨床曲霉菌感染高危病患的血液標(biāo)本80例，參照文獻(xiàn)設(shè)定的納入標(biāo)準(zhǔn)為[6?7]：G試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性（＞60 pg／mL）；免疫力低下；至少符合以下情況之一，接受造血干細(xì)胞移植術(shù)治療，罹患血液疾病，長(zhǎng)期應(yīng)用激素類藥物，對(duì)于常規(guī)抗生素治療無(wú)效的發(fā)熱或胸部浸潤(rùn)，影像學(xué)檢查提示真菌感染。根據(jù)2008年修訂的EORTC／MSG標(biāo)準(zhǔn)[8]及參考臨床診斷結(jié)論，可分為8例確診（Proven IA），26例擬診（Probable IA）及46例非IA病例。血液標(biāo)本應(yīng)在抗真菌治療前進(jìn)行采集，離心分離出血清后用Ep管分裝3管，凍存于?80℃冰箱中備用，于3 d內(nèi)完成RNA提?。∟ASBA檢測(cè)）、DNA提?。≒CR檢測(cè)）及GM試驗(yàn)檢測(cè)。

1．2 儀器與試劑

水浴箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司），熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI 7500），酶標(biāo)儀（Tecan奧地利有限公司），QIAamp DNA Blood Kit（德國(guó)QIAGEN），血液總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），曲霉菌半乳甘露聚糖定性檢測(cè)試劑盒（天津貽諾琦生物工程有限公司），SYBR Premix ExTaqTMII試劑盒、NTP、dNTP、T7 RNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（寶生物工程有限公司），RNasin?Plus RNase Inhibitor、牛血清白蛋白（BSA）（美國(guó)Promega），RNase H（加拿大Fermentas公司）。

1．3 引物設(shè)計(jì)與合成

引物序列均參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5，9]，NASBA擴(kuò)增片段位于18S rRNA的一段高度保守區(qū)域，引物序列為F：AATTCTAATACGACTCACTATAGGG?GAGCAAAGGCCTGCTTTGAACA（下劃線為T(mén)7 RNA聚合酶識(shí)別序列），R：GCCGCGGTAATTC?CAGCTCCAATA；real?time PCR靶片段為曲霉菌28S rRNA基因上的一段保守序列。引物序列為F：GCACGTGAAATTGTTGAAAGG，R：CAGGCTGGC?CGCATTG。引物委托Life technologies公司合成。

1．4 血清游離RNA、DNA的提取

將凍存的標(biāo)本從冰箱取出后復(fù)溫，利用QIAamp DNA Blood Kit提取血清中的游離DNA，利用血液總RNA快速提取試劑盒提取血清中的游離RNA，主要操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取后的DNA、RNA凍存于?80℃冰箱中備用。

1．5 NASBA檢測(cè)曲霉菌方法建立及標(biāo)本檢測(cè)

NASBA反應(yīng)體系主要包括3個(gè)部分即反應(yīng)緩沖液、擴(kuò)增模板及擴(kuò)增酶混合物。本研究20 μL反應(yīng)體系包括反映緩沖液10 μL[40 mmol／L pH8．5 的Tris?HCl，70 mmol／L KCl，5 mmol／L二硫蘇糖醇（DTT），12 mmol／L MgCl2，0．375 mol／L山梨醇，12U RNasin?Plus RNase Inhibitor，1 μmol／L dNTP，2 μmol／L NTP，0．4 μmol／L引物及10%二甲基亞砜（DMSO）]，緩沖液各成分輕輕渦旋混勻后離心，然后加入曲霉菌模板RNA 5 μL。緩沖液和模板的混合物輕輕渦旋混勻后離心，反應(yīng)管置于65℃、5 min，41℃、5 min，預(yù)溫后向反應(yīng)管中加入酶混合物[包括40U T7 RNA聚合酶，8U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，0．1U RNA酶H，2 μg牛血清白蛋白]，補(bǔ)充無(wú)RNA酶水至反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)混合物輕輕渦旋混勻后離心，41℃、90 min，反應(yīng)后產(chǎn)物利用1%的電泳進(jìn)行分析。反應(yīng)體系設(shè)空白對(duì)照（模板為無(wú)菌雙蒸水），陰性對(duì)照（模板為健康者血漿循環(huán)RNA）及陽(yáng)性對(duì)照（模板為煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)株提取的RNA）[3]。

1．6 Real?time PCR檢測(cè)曲霉菌方法建立及標(biāo)本檢測(cè)

參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ建立real?time PCR檢測(cè)曲霉菌感染的方法，主要操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。建立的20 μL反應(yīng)體系成分包括10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ（2×），上下游引物各0．8 μL，0．4 μL ROX reference DyeⅡ（50×），2 μL DNA模板，6 μL無(wú)菌蒸餾水。反應(yīng)體系設(shè)空白對(duì)照（模板為無(wú)菌雙蒸水），陰性對(duì)照（模板為健康者血漿循環(huán)DNA）及陽(yáng)性對(duì)照（模板為煙曲霉提取的DNA）。全部標(biāo)本檢測(cè)完畢后，以EORTC／MSG診斷標(biāo)準(zhǔn)為參考方法建立ROC曲線，確立最佳Ct閾值，并以此界值判定熒光定量PCR的結(jié)果。

1．7 GM試驗(yàn)

利用曲霉菌半乳甘露聚糖定性檢測(cè)試劑盒（ELISA法）對(duì)血清半乳甘露聚糖進(jìn)行檢測(cè)，主要操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。質(zhì)控、對(duì)照及標(biāo)本的OD值通過(guò)Tecan酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm。待測(cè)樣本中的半乳甘露聚糖存在與否取決于每個(gè)樣本檢測(cè)值的計(jì)算指數(shù)GMI，GMI＝cut?off質(zhì)控OD值／2×樣本OD值，若GMI＜0．5，則定為陰性；GMI≥0．5，則定為陽(yáng)性。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每種診斷試驗(yàn)方法的性能參數(shù)（靈敏度、特異度等）通過(guò)構(gòu)建的2×2表格進(jìn)行計(jì)算，以2008年修訂的EORTC／MSG標(biāo)準(zhǔn)[8]為“金標(biāo)準(zhǔn)”，IA確診組及擬診組被定義為真陽(yáng)性。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS Statistics 20．0構(gòu)建ROC曲線，P＜0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Youden指數(shù)用來(lái)評(píng)估每種診斷方法的綜合能力。

2　 結(jié) 果

2．1 高危病患

本研究最終總共納入80例IA高危病患，根據(jù)2008年修訂的EORTC／MSG標(biāo)準(zhǔn)及參考臨床診斷結(jié)論，可分為8例確診（Proven IA），26例擬診（Probable IA）及46例非IA病例。人口統(tǒng)計(jì)資料如表1所示。

2．2 Real?time PCR

Real?time PCR以EORTC／MSG標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)建立ROC曲線，確立最佳閾值，并以此判定結(jié)果（見(jiàn)圖1）。經(jīng)過(guò)分析，real?time PCR的最佳Ct閾值設(shè)定為39．2。

確立診斷標(biāo)準(zhǔn)后，NASBA、real?time PCR及GM試驗(yàn)對(duì)80例IA高危病患標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果如圖2及表2所示。

表2　NASBA、real?time PCR及GM試驗(yàn)的IA診斷結(jié)果（n）Tab．2 Results of NASBA，real?time PCR and GM test for diagnosis of IA

圖1　 Real?time PCR ROC曲線 圖2　 NASBA檢測(cè)血液標(biāo)本曲霉菌電泳結(jié)果（部分）Fig．1 ROC curve of real?time PCR assay Fig．2 Electrophoresis re?sults of blood samples tested by NASBA（part）

2．3 3種IA診斷方法的準(zhǔn)確性

為評(píng)價(jià)3種IA診斷方法的準(zhǔn)確性，可計(jì)算出每種診斷方法的效能指標(biāo)，如表3所示。通過(guò)比較可以看出，NASBA最為靈敏，在陰性似然比、陰性預(yù)測(cè)值、Youden指數(shù)方面表現(xiàn)最好；real?time PCR則是最特異的方法，且在陰性似然比、陰性預(yù)測(cè)值、Kappa方面表現(xiàn)最好。

2．4 最佳方案

為找出IA實(shí)驗(yàn)室診斷的最佳方案，我們對(duì)3種方法的兩兩組合（串聯(lián)試驗(yàn)與并聯(lián)試驗(yàn)）進(jìn)行了比較，并計(jì)算出各種聯(lián)合診斷方案的性能指標(biāo)（見(jiàn)表4）。從表中可以看出，NASBA與real?time PCR串聯(lián)方案有最好的特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；NASBA 與real?time PCR并聯(lián)方案則在靈敏度、陰性似然比、陰性預(yù)測(cè)值、Youden指數(shù)方面表現(xiàn)最好，結(jié)果如表4所示。

表3　NASBA、real?time PCR及GM試驗(yàn)對(duì)IA診斷效能Tab．3 Diagnostic performance of NASBA，qPCR and GM test

表4　NASBA、Real?time PCR及GM試驗(yàn)的聯(lián)合診斷效能Tab．4 Diagnostic performance of combination of NASBA，qPCR and GM test

3　 討 論

IA在免疫力低下患者中的發(fā)病率和死亡率很高。但有報(bào)道顯示：目前僅有6%的IA高危病患能得到一個(gè)明確的診斷[10]。傳統(tǒng)的診斷方法，比如微生物培養(yǎng)及組織病理學(xué)檢查，因敏感度太低而可能漏檢大部分曲霉菌。盡管有報(bào)道顯示在體外實(shí)驗(yàn)中，1～10 CFU的曲霉菌孢子接種到血培養(yǎng)瓶中可在48 h內(nèi)可被檢測(cè)出來(lái)，但是實(shí)際臨床中，曲霉菌培養(yǎng)的陽(yáng)性結(jié)果卻很少見(jiàn)，這可能與體內(nèi)免疫細(xì)胞的吞噬作用有關(guān)[10]。近年來(lái)，通過(guò)傳統(tǒng)的組織學(xué)方法、影像學(xué)與抗原檢測(cè)等聯(lián)合應(yīng)用提高了對(duì)于IA的診斷[11]。然而，影像學(xué)特異性不足，GM試驗(yàn)干擾因素較多，早期而又精確的IA診斷依然存在困難。

過(guò)去的幾十年里，微生物分子檢測(cè)方法取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的方法，包括PCR、NASBA已經(jīng)在IA診斷上顯示出巨大潛力。在本次研究中，我們利用兩種核酸檢測(cè)方法（real?time PCR和NASBA）及一種抗原檢測(cè)方法（GM試驗(yàn)）檢測(cè)IA高危病患的血液標(biāo)本并對(duì)3種方法進(jìn)行評(píng)估。

研究結(jié)果顯示，NASBA是最敏感的方法（76．47%），并且有最好的陰性似然比，陰性預(yù)測(cè)值及尤登系數(shù)，這與Torelli R[12]及Zhao Y[13]之前報(bào)道的NABSA用于曲霉菌檢測(cè)的良好表現(xiàn)相一致（見(jiàn)表3）。除此以外，相比于real?time PCR及GM試驗(yàn)，NASBA的擴(kuò)增時(shí)間短，檢測(cè)設(shè)備成本低，容易操作，適于IA高危病患的篩查，有應(yīng)用于臨床的潛能。NASBA的缺點(diǎn)在于檢測(cè)對(duì)象為RNA，所以樣品采集及檢測(cè)過(guò)程要求較高。在將來(lái)進(jìn)一步的研究中，結(jié)合分子信標(biāo)有望實(shí)現(xiàn)進(jìn)行定量檢測(cè)。

本次研究中，real?time PCR是特異性最高的方法，達(dá)到89．13%，與Bernal?Martínez等[14]的報(bào)道相差不大（93．9%）。Real?time PCR有最好的陽(yáng)性似然比、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及Kappa值（見(jiàn)表3），顯示此方法適于確診IA高危者，或是排除可疑病患。但re?al?time PCR的靈敏度僅有67%，這可能與所檢測(cè)的標(biāo)本為血清有關(guān)，有報(bào)道顯示血清中存在的曲霉菌DNA少于全血標(biāo)本。為了使PCR標(biāo)準(zhǔn)化，提高檢測(cè)效能，2010年發(fā)布的歐洲曲霉菌PCR倡議書(shū)推薦使用更大的標(biāo)本量，更小的DNA洗脫體積[15]。除此以外，自動(dòng)化的核酸提取系統(tǒng)能夠簡(jiǎn)化提取過(guò)程，節(jié)省時(shí)間，將DNA污染降到最低。

GM試驗(yàn)盡管已被納入EORTC／MSG的標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度較低（52．94%）而特異性（80．43%）尚可接受，表明GM應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行至少2次檢測(cè)以提高診斷效能[16]。

此外，半乳甘露聚糖（GM）一般在曲霉菌快速增殖時(shí)釋放入血，而曲霉菌游離核酸的釋放則是菌絲自我分解或是宿主免疫反應(yīng)的結(jié)果。兩種靶標(biāo)的釋放時(shí)機(jī)并不一致[17]，故兩種方法聯(lián)用在特定情況下能取得更好效果。我們的結(jié)果顯示，NASBA 與real?time PCR的串聯(lián)應(yīng)用有最好的特異度（100%）及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（100%）。這種診斷策略對(duì)于排除IA可疑者十分有用，從而減少免疫低下患者的誤診。另一方面NASBA與real?time PCR的并聯(lián)使用有最高的靈敏度（94．12%）及尤登系數(shù)（0．6292），更適于篩查IA高危病患，有作為常規(guī)臨床應(yīng)用的潛能。

我們的研究表明，NASBA用于診斷IA最為敏感，而real?time PCR則最為特異，GM的表現(xiàn)差于前兩者。聯(lián)合應(yīng)用的診斷策略能夠提高診斷效能，應(yīng)根據(jù)臨床需要進(jìn)行選擇相應(yīng)的診斷策略，為IA的早期診斷提供可靠依據(jù)。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

·短篇論著·The application of nucleic acid sequence?based amplification，real?time PCR and GM test in invasive aspergillosis diagnosisWANG Li?peng，BAO Cui?xia，YU Li?mei，ZHANG Xiao?lu，YU Wei?juan，ZHANG Xia，LI Wei，HUANG Bao?hua，LI Jie，SUN Cheng?ming

（Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital，Medical College of Qingdao University，Yantai 264000）

【Abstract】Objective To study the diagnostic performance of nucleic acid sequence?based amplification（NASBA）assay，real?time PCR and GM test in detecting invasive aspergillosis for clinical diagnosis．Methods Blood samples from 80 patients at a high risk for IA were collected during from November 2013 to June 2014．These patients were categorized as 8 proven IA，26 probable IA，and 46 non?IA according to the 2008 revised definitions of EORTC／MSG．Blood samples were tested by NASBA，real?time PCR and GM test and their diagnostic parameters were calculated，respectively．Result The sensitivity of NASBA，real?time PCR and GM test was 76．47%，67．65%and 52．94%，while their specificity was 80．43%，89．13%，80．43%，respectively．The efficiency of various com?binations of tests was also evaluated．Perfect specificity（100%）and positive predictive value（100%）were achieved by combining NASBA and real?time PCR as a serial testing．A combination of NASBA and real?time PCR as a parallel testing was the most sensitive （94．12%）．Conclusion The sensitivity and specificity of NASBA and real?time PCR were superior to GM test．Combination of these assays could be particularly useful in specific clinical situations．

【Key words】invasive aspergillosis；nucleic acid sequence?based amplification；real?time PCR；GM test

[收稿日期]2015?06?03

【文章編號(hào)】1673?3827（2015）10?0283?05

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 379．6

通訊作者：黃葆華，E?mail：huangbaohua2010＠126．com

作者簡(jiǎn)介：王立朋，男（漢族），碩士，檢驗(yàn)師．E?mail：wlp924577010 ＠163．com