賀羽黃夢雅胡青碧周汛，2（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶40006；2．重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶40002）

?

中國南北方地區(qū)臨床孢子絲菌菌種鑒定

賀羽1黃夢雅1胡青碧1周汛1，2
（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶400016；2．重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶400021）

【摘要】目的 對分離自我國南、北方地區(qū)50株臨床孢子絲菌進行菌種鑒定。方法 分離菌株分別進行25℃恒溫培養(yǎng)和玻片小培養(yǎng)，肉眼和鏡下觀察形態(tài)特征；同時提取菌絲相基因組DNA，用PCR分別擴增部分微管蛋白（β?tubulin）基因和核糖體內部轉錄間隔區(qū)（Ribosomal Internal Transcribed Spacer，ITS），擴增產(chǎn)物進行測序，并采用最大似然法（maximum likeli?hood，ML）和鄰接法（neighbor?joining，NJ）構建聯(lián)合β?tubulin基因和ITS區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹。結果 結合形態(tài)學及系統(tǒng)發(fā)育分析，50株菌均鑒定為球形孢子絲菌（Sporothrix globosa，S．globosa）。結論 球形孢子絲菌是目前我國南、北方地區(qū)孢子絲菌病的主要致病菌種，為進一步明確我國孢子絲菌病致病菌種的分布提供了依據(jù)。

【關鍵詞】孢子絲菌；形態(tài)學；系統(tǒng)發(fā)育；球形孢子絲菌

Species identification of Sporothrix clinical isolates in Northern and Southern of ChinaHE Yu

1

，HUANG Meng?Ya

1

，HU Qing?bi

[Chin J Mycol，2015，10（5）：279?282]

孢子絲菌是雙相型真菌，普遍存在于自然界，可從土壤和腐爛植物中分離[1]。該菌包括巴西孢子絲菌、球形孢子絲菌、申克孢子絲菌等6個菌種[2]。孢子絲菌感染人或動物后可引起孢子絲菌病，主要表現(xiàn)為皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統(tǒng)的慢性肉芽腫性病變[3]，可經(jīng)血液、淋巴系統(tǒng)擴散累及心、肺、腦等臟器，具有一定的致殘率和致死率[4]。各個菌種在地理分布、毒力及對抗真菌藥物敏感性等方面存在差異，可能是基因多態(tài)性所致[3，5]，因此明確致病菌種類型在治療及預后方面有重要的指導意義。

在我國孢子絲菌病是僅次于念珠菌病和曲霉病的深部真菌病，東北部是好發(fā)地區(qū)[6]。以往經(jīng)形態(tài)學鑒定認為我國的致病菌種為申克孢子絲菌，隨著生物信息技術的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)球形孢子絲菌是目前我國的主要致病菌種[7?8]，但需要更多的臨床樣本證實。本實驗對我國南、北方地區(qū)50株臨床菌株進行形態(tài)學觀察及系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為明確我國孢子絲菌病致病菌種分布情況提供依據(jù)。

1　 材料與方法

1．1 材料

實驗菌株 50株孢子絲菌分離自孢子絲菌病患者皮損處。22株來自重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，編號C01?C22。14株來自吉林大學第二醫(yī)院，編號J14?J28。14株來自北京大學附屬醫(yī)院，編號B04481?B04494。

培養(yǎng)基及試劑 2%馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrse Agar Medium，PDA），DNAMark?er1000，Premix TaqTM（TaKaRa，Japan），溴化十六烷基三甲胺等DNA提取相關試劑。

1．2 形態(tài)學觀察

肉眼觀察 將菌株分別接種在2%PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)14 d，肉眼觀察菌落形態(tài)結構。

鏡下觀察 所有菌株進行玻片小培養(yǎng)[9]，7 d后顯微鏡下觀察形態(tài)特征。

1．3 分子生物學鑒定

DNA提取 將菌株接種于2%PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后提取菌絲相DNA[10]。用Nan?oDrop分光光度計評估DNA，光密度值在1．8～2．0提示純度較高，并調整濃度為100～300 ng／μL以備PCR擴增。

PCR擴增ITS序列及β?tubulin基因 分別用引物BT2a／BT2b、ITS1／ITS4擴增β?tubulin基因和ITS序列[7]，引物由北京華大基因公司合成。PCR反應條件參照Premix?TaqTM使用說明書。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)記錄結果。

PCR產(chǎn)物序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR產(chǎn)物交由北京華大基因公司進行雙向測序。測序結果在BLAST（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast）上進行比對，確認為孢子絲菌序列后，用Bioedit軟件拼接兩組序列。在NCBI中下載孢子絲菌6個菌種和同源物種Ophiostoma nigrocarpum（O．nigro?carpum）的β?tubulin基因及ITS序列作為參考序列并進行拼接。登陸http：／／www．ebi．a(chǎn)c．uk／Tools／msa／mafft進行多序列比對，將比對結果導入MEGA5軟件，采用ML法和NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用1 000次自引導法重復檢測發(fā)育樹分支置信度[11]。

2　 結 果

2．1 形態(tài)學觀察

肉眼觀察 25℃恒溫培養(yǎng)3～4 d后出現(xiàn)白色、乳白色菌落，后顏色逐漸加深為棕色或黑色，部分菌落保持白色；菌落呈橢圓形，表面有皺褶或毛刺，中央略高起，邊緣可見膜狀乳白色暈。14 d后可見3種顏色的菌落（見圖1）。

顯微鏡下觀察 7 d后鏡下見細長菌絲兩側直角分出分生孢子柄，頂端有圓形或卵圓形分生孢子，呈花瓣狀排列，部分孢子直接沿菌絲兩側生長（見圖2）。

2．2 分子生物學鑒定

PCR擴增結果 ITS區(qū)域擴增產(chǎn)物約600 bp（見圖3），β?tubulin基因擴增產(chǎn)物約400 bp（見圖4），符合孢子絲菌該基因片段長度，所有菌株均測序成功。

成功構建系統(tǒng)發(fā)育樹 所有菌株ITS序列及β?tubulin基因與球形孢子絲菌（CBS120340）有98%以上的相似性，進化距離最近，在ML樹和NJ樹中處于同一分支，故鑒定為球形孢子絲菌（見圖5）。

3　 討 論

孢子絲菌于1989年由美國人Shenk首次在患者皮損處分離，故命名為申克孢子絲菌，以往認為申克孢子絲菌是國內外孢子絲菌病的唯一致病菌種[12]，近年來發(fā)現(xiàn)該菌并非單一的菌種，而是6個菌種構成的復合體。巴西孢子絲菌僅見于巴西，申克孢子絲菌多見于美洲、非洲、亞洲，球形孢子絲菌在全世界廣泛分布[13]，其余3個菌種報道較少。孢子絲菌常通過接種于人或動物的皮膚傷口而致病，臨床分為固定型、淋巴管型、皮膚外型、播散型[1]，臨床型別的差異主要與孢子絲菌毒力、接種量及宿主免疫功能等有關[14]。Arrillaga?Moncrief等[15]研究發(fā)現(xiàn)巴西孢子絲菌、申克孢子絲菌毒力最強，球形孢子絲菌次之，前者可經(jīng)血液或淋巴擴散引起播散型孢子絲菌病[4]，后者以皮膚固定型孢子絲菌病多見，目前兩性霉素B聯(lián)合伊曲康唑是播散型的一線治療藥物，而單用伊曲康唑是固定型的一線治療藥物[1]。毒力的大小與產(chǎn)色素能力、耐熱性等密切相關[14]，巴西孢子絲菌、申克孢子絲菌可產(chǎn)生大量色素使菌落黑化，且耐熱力強，37℃體外培養(yǎng)時生長良好，而球形孢子絲菌色素生成相對較少，耐熱力較差，37℃培養(yǎng)時生長明顯受抑制[16?17]。Marimon等[18]對不同國家的5個菌種進行抗真菌藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)所有菌株對特比萘芬最敏感，巴西孢子絲菌對抗真菌藥物最敏感，墨西哥孢子絲菌最不敏感，而Ottonelli[19]研究發(fā)現(xiàn)巴西地區(qū)的不同菌種對抗真菌藥物的敏感性沒有明顯差異，認為與Marimon的實驗結果不同的原因在于菌株收集局限在巴西，而非來自不同國家?？梢姼鱾€菌種在地理分布、毒力及抗真菌藥物敏感性等方面存在差異，因此明確致病菌種類型在治療及預后方面有重要的指導意義。

圖1　 25℃培養(yǎng)14 d后孢子絲菌菌落形態(tài)：a．黑色菌落，b．乳白色菌落，c．棕色菌落 圖2　 孢子絲菌鏡下形態(tài)（一比例尺＝10 μm）：a．大量圓形分生孢子；b．大量卵圓形分生孢子；c．菌絲密集分布，少量孢子著生于菌絲兩側 圖3　 β?tubulin擴增產(chǎn)物電泳圖（a：1．Marker 1 000 bp，2?26．C01?C22、J15、J16、J17：β?tubulin基因；b：1．Marker 1 000 bp，2?26．J17?J28、B04481?B04489：β?tubulin基因） 圖4　 ITS擴增產(chǎn)物電泳圖（a：1．Marker 1 000 bp，2?26．C01?C22、J15、J16、J17：ITS基因；b：1．Marker 1 000 bp；2?26．J17?J28、B04481?B04489：ITS基因）Fig．1 General conformation of Sporothrix cultured on 2%PDA at 25℃in 14 days：a．Black colony，b．White colony，c．Brown colony Fig．2 Micros?copy of Sporothrix（a scale bars＝10 μm）：a．Abundant of round spores，b．Abundant of oval?shaped spores，c．Amount of hyphae with less spores Fig．3 PCR products of β?tubulin（a：1．Marker1 000 bp；2?26．C01?C22，J15，J16，J17：β?tubulin genes．b：1．Marker1 000 bp；2?26．J17?J28，B04481?B04489：β?tubulin genes） Fig．4 PCR products of ITS（a：1．Marker 1 000 bp；2?26．C01?C22，J15，J16，J17：ITS genes．b：1．Marker 1 000 bp；2?26．J17?J28，B04481?B04489：ITS genes）

圖5　 聯(lián)合β?tubulin基因和ITS序列的系統(tǒng)進化樹（O．nigrocarpum是樹根，鄰近樹枝的數(shù)值代表的是1 000次自引導法重復檢測下（ML／NJ）樹的自檢舉支持率）Fig．5 Phylogenetic relationships of β?tubulin genes and ITS sequences （Thephylogenetic tree is rooted with O．nigrocarpum．The number closed to branches represent indices of support（ML／NJ）based on 1 000 boot?strap replications）

孢子絲菌復合體各隱含種形態(tài)相近[1，17]，觀察形態(tài)結構不能準確鑒定菌種類型。有研究者采用Marimon區(qū)分各菌種的表型試包括碳源同化、37℃生長情況及28℃接種于PDA培養(yǎng)基上菌落直徑和系統(tǒng)發(fā)育分析對孢子絲菌進行鑒定發(fā)現(xiàn)10．1%的菌株通過表型特征不能準確鑒定菌種類型[20]，Ot?tonelli的試驗中表型同基因型鑒定結果的差異高達37．7%[19]，而譚靜文等[21]對我國臨床菌株進行表型和基因型鑒定發(fā)現(xiàn)兩種方法的結果一致，可見對于表型實驗鑒定菌種類型的準確性并未達成共識。Oliveira等[22]首次將基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜術用于孢子絲菌菌種分類，認為通過蛋白質譜分析能準確、快速鑒定6個菌種，但目前該技術應用甚少，仍需大量實驗進行驗證。分子生物學方法可從基因水平上檢測孢子絲菌，PCR、巢式PCR、肽指紋圖譜分析等技術已被用于鑒定孢子絲菌，并且在菌種分類上具有顯著優(yōu)勢，Marimon等[2]利用CAL基因將其分為6個菌種，Camacho等[23]利用CAL基因及ITS序列鑒定發(fā)現(xiàn)委內瑞拉地區(qū)存在申克孢子絲菌和球形孢子絲菌兩個種。

本研究對臨床菌株進行形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)50株菌株均符合孢子絲菌的形態(tài)學特點，但據(jù)此不能準確鑒定菌種類型。通過聯(lián)合β?tubulin基因和ITS區(qū)域構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，所有菌株均鑒定為球形孢子絲菌，與之前的研究結果一致[7?8，21]，進一步證實了我國南、北方地區(qū)分布的孢子絲菌以球形孢子絲菌為主，為明確我國孢子絲菌菌種分布提供了依據(jù)。PCR及其相關技術是目前鑒定孢子絲菌的主要分子生物學技術，但因技術要求較高，目前未廣泛用于臨床診斷，僅限于實驗室研究，因此我們將進一步探索設計針對各菌種間多位點差異序列的種特異性引物，應用環(huán)介導等溫擴增技術（Loop?mediated isothermal Amplication，LAMP）等更為簡單、快速的新興技術實現(xiàn)對孢子絲菌病致病菌種的鑒定。

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[本文編輯] 施 慧

·論著·

1

，ZHOU Xun

1，2

（Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2．Department of Dermatology and Cosmetology，Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400021，China）

【Abstract】Objective To identify 50 Sporothrix clinical isolates in Northern and Southern of China．Methods All isolates from patients were subcultured at 25℃and morphological characteristic was analysed by microscope and visual inspection．The total ge?nomic DNA was extracted to amplify the partial β?tubulin gene and the internal transcribed（ITS）region by polymerase chain reac?tion（PCR）．The phylogenetic tree was constructed by DNA sequences analyses based on datasets of ITS and a combined ITS and partial β?tubulin region using maxium likehood（ML）and neighbor?joining（NJ）methods with MEGA5 software．The Reference se?quences used for phylogenetic analyses were retrieved from GenBank．Result The macroscopic morphologies and microscopic fea?tures of all isolates were comformed to Sporothrix spp．The phylogenetic tree showed that all of the isolates were clustered in a distinct clade with a type of Sporothrix globosa．Conclusion S．globosa may be the major Sporothrix existing in northern and southern of Chi?na，which can provide basis for the epidemiological investigation of Sporothrix．

【Key words】Sporothrix；morphology；phylogeny；Sporothrix globosa

[收稿日期]2015?06?23

基金項目：國家自然科學基金（31270062）

【文章編號】1673?3827（2015）10?0279?04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 519．8

通訊作者：周汛，E?mail：zhouxun123＠sina．com

作者簡介：賀羽，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：15123825300 ＠163．com