于曉龍， 楊建玲， 朱樂， 樸美善， 郭建鵬,2*

( 1.延邊大學(xué)藥學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2.長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室(延邊大學(xué))， 吉林 延吉 133002 )

平貝母醇提物對小鼠免疫功能的影響

于曉龍1， 楊建玲1， 朱樂1， 樸美善1， 郭建鵬1,2*

( 1.延邊大學(xué)藥學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2.長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室(延邊大學(xué))， 吉林 延吉 133002 )

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定平貝母醇提物對小鼠免疫功能的影響.結(jié)果顯示，平貝母醇提物對小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD69+/CD3+比值、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球吞噬百分率具有顯著性影響(P<0.05),對脾臟NK細(xì)胞CD69+/NKG2D+比值具有極顯著性影響(P<0.01).這表明平貝母醇提物具有增強小鼠免疫功能的作用.

平貝母； 免疫功能； 流式細(xì)胞術(shù)

平貝母(FritillariaussuriensisMaxim)為百合科貝母屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國東北地區(qū)的長白山脈和小興安嶺南部山區(qū)，其味苦、甘、微寒，臨床用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、咳痰帶血等[1].研究表明，平貝母中含有生物堿類、生物堿苷類及核苷類成分，其提取物具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗?jié)?、抗炎等作用[2-4].免疫功能是機體自身的防御機制，是識別和消滅外來侵入的異物，處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力，免疫功能的強弱與遺傳和環(huán)境因素有關(guān).本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，以細(xì)胞免疫功能、單核/巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性測定結(jié)果為評價指標(biāo)[5-6]，初步考察平貝母醇提物對小鼠免疫功能的影響，為平貝母的進一步開發(fā)利用提供依據(jù).

1 實驗材料

1.1 實驗動物

無特定病原體(specific pathogen free, SPF)昆明種雄性小鼠90只(體重18～22 g),豚鼠5只(體重250～300 g),均由延邊大學(xué)實驗動物中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(吉)2011-0007).飼料由延邊大學(xué)實驗動物中心提供.實驗室為SPF級動物實驗室，室溫為(20±2) ℃，濕度為50%～60%.

1.2 實驗藥材

平貝母采收于吉林省敦化市平貝母栽培基地，并經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院呂惠子副教授鑒定.

1.3 實驗儀器

實驗儀器有流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)，數(shù)碼倒置顯微鏡(XDS-100D)，冷凍干燥機(VIRTIS-BT2K).

1.4 實驗試劑

小鼠CD69異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記(Cat:1715-02)、CD3藻紅色素(PE)標(biāo)記(Cat:553067)、NKG2D藻紅色素(PE)標(biāo)記(Cat:E008303)單克隆抗體、溶血素均為美國BD PharMingen公司產(chǎn)品；熒光微球(F-20880)為美國Moleculer Probes公司產(chǎn)品；Hank’s液(H1020)為Solarbio公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)為美國Ameresco公司產(chǎn)品；胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)為美國Gibco公司產(chǎn)品；綿羊血紅細(xì)胞液(SRBC)與磷酸鹽緩沖液(PBS)為本實驗室自行制備，其他試劑均為分析純.

2 實驗方法

2.1 平貝母醇提物的制備

將平貝母除去雜質(zhì)后粉碎，得粗顆粒；加10倍量80%(體積比)乙醇超聲(240 W，40 kHz)提取2次，每次30 min，過濾，合并濾液；濾液濃縮，冷凍干燥，得平貝母醇提物粉末，備用.

2.2 給藥方式[6]

給藥方式采取灌胃法，平貝母醇提物混懸于水中，每日灌喂1次，空白對照組以等量生理鹽水灌胃.給藥期間動物自由攝水、攝食，各受試組小鼠連續(xù)灌胃30 d后，測定各項指標(biāo).

2.3 平貝母醇提物對小鼠外周血及脾臟T淋巴細(xì)胞表面活化抗原的影響

小鼠連續(xù)灌胃30 d后，脫頸椎處死，參照文獻[7]方法測定.小鼠無菌取脾，制成濃度為5×105的單細(xì)胞懸液，然后與1 μL小鼠CD69異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記單克隆抗體和5 μL小鼠CD3藻紅色素(PE)標(biāo)記單克隆抗體混合，室溫下避光孵育30 min；用0.5 mL溶血素準(zhǔn)確裂解紅細(xì)胞10 min，在1 300 r/min條件下離心5 min獲取有核細(xì)胞，用PBS洗滌2次后上流式細(xì)胞儀分析.

2.4 平貝母醇提物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

小鼠連續(xù)灌胃30 d后，脫頸椎處死，參照文獻[8-10]方法測定.熒光微球預(yù)調(diào)理:用PBS配制體積濃度為1% 的BSA溶液，按1∶100稀釋微球儲存液，37 ℃孵育30 min后,超聲處理5 min.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離:實驗4 d前腹腔注射0.2 mL 2%(體積比) SRBC激活巨噬細(xì)胞，實驗當(dāng)天將小鼠頸椎脫臼處死，暴露腹膜，經(jīng)腹腔注射7 mL Hank’s液(含5% FBS)；將小鼠腹部向上置于搖床上搖晃3 min，剪開腹部，吸取腹腔洗液于15 mL離心管中，冰浴.細(xì)胞計數(shù)：取6×105個細(xì)胞至1.5 mL試管中，每個試管加入220 μL預(yù)調(diào)理過的熒光微球懸液.吞噬作用:室溫避光孵育30 min后，以2 mL PBS輕柔洗滌2次(洗除多余未消化的熒光微球)，然后用細(xì)胞刮刮下尚未脫壁的巨噬細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，75 μm過濾器過濾，根據(jù)細(xì)胞密度用0.2 mL PBS定容后上流式細(xì)胞儀分析.

2.5 平貝母醇提物對小鼠外周血及脾臟NK細(xì)胞表面活化抗原的影響

小鼠連續(xù)灌胃30 d后，參照文獻[7]方法測定.采小鼠眼球血，肝素抗凝；取50 μL全血與1 μL小鼠CD69異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記單克隆抗體和5 μL小鼠NKG2D藻紅色素(PE)標(biāo)記單克隆抗體混合，室溫下避光孵育30 min；用0.5 mL溶血素準(zhǔn)確裂解紅細(xì)胞10 min，在1 300 r/min條件下離心5 min獲取有核細(xì)胞，用PBS液洗滌2次后上流式細(xì)胞儀分析.

2.6 流式細(xì)胞儀分析

標(biāo)記的細(xì)胞經(jīng)前向散射(FSC)和縱向散射(SSC)在二維Dot-Plot圖中劃出巨噬細(xì)胞區(qū)，然后對巨噬細(xì)胞作FITC熒光強度檢測，485 nm處作為激發(fā)波長，530 nm處作為發(fā)射波長，數(shù)據(jù)顯示于FL1-FSC二維散點圖和FL1直方圖中.每組分析10例動物樣本，每例樣本獲取10 000個巨噬細(xì)胞，用Cell-Quest軟件分析吞噬不同熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例.

2.7 統(tǒng)計分析結(jié)果

所有數(shù)據(jù)均采用SSPS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析.首先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值.F≥F0.05, P≤0.05表明各組間呈顯著性差異.

3 結(jié)果

3.1 平貝母醇提物對小鼠外周血及脾臟T淋巴細(xì)胞表面活化抗原的影響

結(jié)果如圖1、表1所示：與對照組相比，高劑量組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD69+/CD3+比值明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中、高劑量組小鼠脾臟T細(xì)胞CD69+/CD3+比值略有增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

3.2 平貝母醇提物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的影響

結(jié)果如圖2、圖3和表2所示：與對照組相比，中劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球吞噬百分率明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球吞噬百分率略有增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

3.3 平貝母醇提物對小鼠外周血及脾臟NK細(xì)胞表面活化抗原的影響

結(jié)果如圖4、表3所示：與對照組相比，中劑量組小鼠脾臟NK細(xì)胞CD69+/NKG2D+比值明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；中、高劑量組小鼠外周血NK細(xì)胞CD69+/NKG2D+比值略有增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).

A: 空白對照組 B: 中劑量組 C: 高劑量組 (右上限為CD69+/CD3+比值)圖1 平貝母醇提物對小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD69+/CD3+比值的影響

組別劑量/(g·kg-1)外周血T淋巴細(xì)胞(CD69+/CD3+)/%脾臟T淋巴細(xì)胞(CD69+/CD3+)/%對照組0．03．89±2．491．92±1．95中劑量組0．145．45±1．844．60±4．79高劑量組0．428．39±5．48?4．25±4．06

注：*表示與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05).

R1：總巨噬細(xì)胞群 R2：未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群 R9：吞噬1個熒光微球的巨噬細(xì)胞群 R10：吞噬2個熒光微球的巨噬細(xì)胞群 R11：吞噬3個熒光微球的巨噬細(xì)胞群圖2 吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞FSC-SSC和FL1-SSC二維散點圖

圖3 吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞FL1直方圖

表2 平貝母醇提物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬 熒光微球的影響

組別劑量/(g·kg-1)吞噬指數(shù)/%P值對照組0．09．29±2．94—中劑量組0．1413．55±1．47?0．047高劑量組0．4214．94±2．930．132

注：*表示與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05).

A: 空白對照組 B: 中劑量組 C: 高劑量組 (右上限為CD69+/NKG2D+比值)圖4 平貝母醇提物對小鼠脾臟NK細(xì)胞CD69+/NKG2D+比值的影響

組別劑量/(g·kg-1)外周血NK細(xì)胞(CD69+/NKG2D+)/%脾臟NK細(xì)胞(CD69+/NKG2D+)/%對照組0．03．70±2．743．40±2．31中劑量組0．145．54±3．4334．55±28．27??高劑量組0．425．39±4．644．77±6．08

注：**表示與對照組比較具有極顯著性差異(P<0.01).

4 結(jié)論

實驗結(jié)果顯示，平貝母醇提物能顯著提高小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD69+/CD3+比值(P<0.05)和小鼠脾臟NK細(xì)胞CD69+/NKG2D+比值(P<0.01)，表明其具有促進免疫細(xì)胞活化的作用.另外，平貝母醇提物還能增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球吞噬百分率(P<0.05)，表明其具有提高單核/巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用，有利于增強機體非特異性免疫功能.以上結(jié)果表明平貝母醇提物有助于增強小鼠的免疫功能，具備進一步開發(fā)為保健食品的潛力.

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The effect of the ethanol extract of Fritillaria ussuriensis Maxim on mice immune function

YU Xiaolong1, YANG Jianling1, ZHU Le1, PIAO Meishan1, GUO Jianpeng1,2*

( 1.CollegeofPharmacy,YanbianUniversity,Yanji133002,China； 2.KeyLaboratoryofNaturalResourcesofChangbaiMountain&FunctionalMolecules(YanbianUniversity),MinistryofEducation,Yanji133002,China)

We measure the effect ofFritillariaussuriensisMaxim ethanol extract on mice immune function based on the flow cytometry. The experimental results show that the ethanol extract ofFritillariaussuriensisMaxim have a significant effect on the ratio of T lymphocytes CD69+/CD3+in mice peripheral blood and phagocytic index for fluospheres in mice peritoneal macrophages (P<0.05), and have a very significant effect on the ratio of NK cell CD69+/NKG2D+in mice spleen (P<0.01). TheFritillariaussuriensisMaxim ethanol extract can enhance the immune function of mice.

FritillariaussuriensisMaxim; immune function; flow cytometry

2015-01-26 *通信作者： 郭建鵬(1971—)，男，教授，研究方向為中藥新劑型與新技術(shù)研究.

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140204034YY)；吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金資助項目(YYZX201269)

1004-4353(2015)01-0085-04

R285

A