吳凡，黃翠姬，劉昭明，黃群，張亞麗

(廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州，545006)

植物乳桿菌屬于腸道內(nèi)微生物菌群的一種，常見于蔬菜發(fā)酵制品［1］。其作為人類消化道中的重要菌群，具有抑制病原菌，修復(fù)腸道黏膜，降低血清膽固醇，提高人體免疫力等益生功能［2-3］。乳酸菌對(duì)人體發(fā)揮益生作用與其能在消化道內(nèi)定植的能力有關(guān)，而黏附則是定植的先決條件［4］。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對(duì)細(xì)胞的黏附是由于細(xì)胞壁中黏附素與宿主表面的受體相結(jié)合的結(jié)果，其黏附性能受到一些外在因素，如周圍環(huán)境的pH值、離子濃度、溫度以及菌體生長(zhǎng)階段等的影響［5-6］。

近兩年來國(guó)內(nèi)外的研究焦點(diǎn)主要集中在乳酸菌黏附力的考察和黏附機(jī)理上，王麗群［7］和李清［8］根據(jù)研究菌株的黏附能力、表面疏水性和自動(dòng)聚集能力三者之間關(guān)系，來判斷菌株黏附性能的強(qiáng)弱。盧千慧［9］通過對(duì)乳桿菌的表面S-層蛋白的研究，深入探討了乳桿菌的黏附機(jī)理。相比之下，對(duì)乳酸菌黏附作用的過程所受到影響因素研究較少且不夠全面。對(duì)影響乳酸菌黏附過程中的因素的研究不僅有助于明確乳酸菌的黏附機(jī)理，而且為其更好地黏附于腸道創(chuàng)造了條件。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，通過考察篩選自泡菜的植物乳桿菌L01黏附于Caco-2細(xì)胞的性能，研究了不同因素對(duì)其黏附效果的影響，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞

植物乳桿菌L01，由廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;人結(jié)腸癌腺細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株，購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

MRS(Man-Rogosa-Sharpe)培養(yǎng)基、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)液、0.25% 胰酶-EDTA，青島海博生物科技有限公司;類胎牛血清，上海玉博科技有限公司。其他試劑均為分析純或化學(xué)純。DMEM完全培養(yǎng)液由78%DMEM培養(yǎng)液、20%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素濃度均為100 U/mL)和1%谷氨酰胺組成，并加入1 mL的NaHCO3作為指示劑。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

將植物乳桿菌L01置于含20%甘油的MRS中-60℃保存，將上述菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，并活化2次。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

采用Caco-2細(xì)胞作為腸上皮細(xì)胞模型，進(jìn)行黏附性試驗(yàn)。Caco-2細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后加入DMEM完全培養(yǎng)液中，放置在CO2培養(yǎng)箱(5%CO2和95%空氣)中，37℃培養(yǎng)，2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70% ～80%貼壁，用0.25%胰酶-EDTA消化傳代，傳代5次左右，大約20天后，將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度約為2×106CFU/cm2，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。

1.5 黏附實(shí)驗(yàn)

1.5.1 黏附觀察

將已經(jīng)長(zhǎng)成單層的Caco-2細(xì)胞用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)洗滌2次。分別向細(xì)胞板的每個(gè)孔中加入1 mL細(xì)菌懸液(1.0×108CFU/mL)，在CO2培養(yǎng)箱(5%CO2和95%空氣)中，37℃環(huán)境中孵育2 h。然后用無菌PBS漂洗細(xì)胞3次，除去未黏附的細(xì)菌。生長(zhǎng)在6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片經(jīng)過漂洗后用0.4%多聚甲醛固定0.5 h，靜置干燥，革蘭氏染色，在細(xì)胞成像儀下觀察植物乳桿菌L01的黏附情況。

1.5.2 黏附計(jì)數(shù)

將細(xì)胞懸浮液直接滴加于六孔培養(yǎng)板中。經(jīng)PBS洗滌后，一部分孔中加入含有200 μg/mL慶大霉素的DMEM不完全培養(yǎng)液2 mL，孵育1 h，之后用PBS漂洗3次，以此來殺死黏附在細(xì)胞表面的細(xì)菌，從而確定侵襲進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)。然后在所有孔中加入0.7 mL胰酶作用10 min，待細(xì)胞完全脫落，再加入0.3 mL不完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)。最后加入0.5 mL 0.1%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，混勻后靜置10 min，以裂解細(xì)胞。將混合物轉(zhuǎn)移到試管中，選取合適稀釋梯度，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。做空白對(duì)照，選取長(zhǎng)至單層的空白細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)處理作3個(gè)平行，并按照公式(1)計(jì)算平均每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.6 不同因素對(duì)菌株黏附性能的影響

乳酸菌的黏附定植主要是通過黏附素和細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合完成，此過程的發(fā)生與菌體生長(zhǎng)階段、溫度、pH、菌濃度、黏附作用時(shí)間、金屬離子濃度以及環(huán)境中單糖種類等其他影響因素有關(guān)。

1.6.1 菌液濃度對(duì)黏附性能的影響

取培養(yǎng)至12 h的L01菌體，調(diào)整其濃度分別為105，106，107，108，109CFU/mL，與細(xì)胞共培養(yǎng) 2 h，計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.6.2 生長(zhǎng)階段對(duì)黏附性能的影響

取培養(yǎng)至 4，8，12，16，20 h的L01菌體，調(diào)整其濃度為1.0×108CFU/mL，與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.6.3 作用時(shí)間對(duì)黏附性能的影響

取培養(yǎng)至12 h的L01菌體，調(diào)整其濃度為1.0×108CFU/mL，與細(xì)胞共培養(yǎng) 0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.6.4 環(huán)境pH值對(duì)黏附性能的影響

取培養(yǎng)至12 h的L01菌體，用不同pH的緩沖液(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)調(diào)整其濃度為 1.0 ×108CFU/mL，與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，計(jì)數(shù)黏附的細(xì)菌數(shù)。

1.6.5 單糖對(duì)黏附的抑制作用

在細(xì)菌懸浮液中分別加入D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甲基-α-D-甘露糖苷(終濃度為100 mmol/L)，與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，考察單糖對(duì)黏附的影響。

1.6.6 二價(jià)金屬離子對(duì)黏附作用的影響

在培養(yǎng)12 h濃度為1.0×108CFU/mL的L01菌懸液中加入 CaCl2和 MgCl2(終濃度分別為0，5，10，15，20 mmol/L)，與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，進(jìn)行黏附試驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Origin9.1對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液濃度對(duì)黏附作用的影響

將菌液L01濃度分別調(diào)整為1×105，1×106，1×107，1 ×108，1 ×109CFU/mL，然后進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌液濃度對(duì)L01黏附于Caco-2的影響Fig.1 The effect of different bacterial concentrations on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

根據(jù)T檢驗(yàn)分析可知，植物乳桿菌L01對(duì)Caco-2的黏附性具有一定的濃度依賴性。當(dāng)濃度從1×106CFU/mL升高至1×109CFU/mL時(shí)，Caco-2上黏附的植物乳桿菌L01菌數(shù)隨著菌液濃度的升高而顯著增加，相應(yīng)值彼此間差異顯著(P＜0.05)，而當(dāng)菌液濃度1×105CFU/mL升高至1×106CFU/mL時(shí)，其黏附數(shù)之間無顯著差異(P＞0.05)。當(dāng)達(dá)到1×109CFU/mL時(shí)，黏附數(shù)為7.76±0.11個(gè)/細(xì)胞，此時(shí)黏附達(dá)到穩(wěn)定。參考李清的研究［8］，可以推測(cè)植物乳桿菌L01與細(xì)胞Caco-2的黏附機(jī)制主要是乳桿菌表面的黏附素與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而形成黏附力。當(dāng)植物乳桿菌L01濃度達(dá)到1×109CFU/mL時(shí)，此時(shí)Caco-2細(xì)胞表面的受體結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到飽和，此時(shí)L01的黏附達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

2.2 生長(zhǎng)階段對(duì)黏附作用的影響

分別取培養(yǎng)時(shí)間為 4，8，12，16，20 h 五個(gè)生長(zhǎng)階段的菌液進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。根據(jù)T檢驗(yàn)分析可知，當(dāng)進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)的菌齡低于12 h時(shí)，黏附的細(xì)菌數(shù)隨著菌齡的增長(zhǎng)顯著增加(P＜0.05)。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間超過12 h，黏附的細(xì)菌數(shù)趨于飽和(P＞0.05)。細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間為16 h時(shí)，植物乳桿菌L01生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定后期。當(dāng)菌齡達(dá)到20 h時(shí)，黏附的細(xì)菌數(shù)有了明顯的降低(P＜0.05)。由此可知，處于穩(wěn)定期的植物乳桿菌L01對(duì)Caco-2具有更好的黏附性。由于植物乳桿菌L01在不同的生長(zhǎng)階段，其形態(tài)結(jié)構(gòu)，菌體表面成分以及代謝產(chǎn)物有較大的不同，因而造成不同的黏附效果。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，處于穩(wěn)定期的L01黏附性最穩(wěn)定，這與其他研究者結(jié)果保持一致［10］?？梢酝茰y(cè)處于穩(wěn)定期的細(xì)菌不管是從數(shù)量還是形態(tài)結(jié)構(gòu)以及表面成分較其他生長(zhǎng)階段都更為穩(wěn)定，可能與其分泌黏附素的性質(zhì)與多少有關(guān)，這就導(dǎo)致了植物乳桿菌L01與Caco-2細(xì)胞受體的結(jié)合更多更穩(wěn)定。

圖2 生長(zhǎng)階段對(duì)L01黏附Caco-2的影響Fig.2 The effect of different growth stage on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

2.3 作用時(shí)間對(duì)黏附作用的影響

將植物乳桿菌L01濃度都調(diào)整為1×108CFU/mL，使其與細(xì)胞分別 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 共孵育后進(jìn)行黏附試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3所示。根據(jù)T檢驗(yàn)分析可知，在2 h之內(nèi)，隨著共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，黏附細(xì)菌數(shù)有顯著增加(P＜0.01)。2 h之后，黏附的細(xì)菌數(shù)變化趨于平緩，彼此之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。植物乳桿菌L01對(duì)Caco-2的黏附作用在一定范圍內(nèi)存在著時(shí)間依附性，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，黏附作用達(dá)到平衡?？梢酝茰y(cè)植物乳桿菌L01與黏附作用時(shí)間存在著時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，需要一定的作用時(shí)間黏附數(shù)才能達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。隨著黏附作用時(shí)間的延長(zhǎng)，黏附的細(xì)菌數(shù)隨之增加，2 h達(dá)到黏附飽和。表明此時(shí)Caco-2細(xì)胞表面的黏附素受體數(shù)量已經(jīng)達(dá)到飽和，黏附數(shù)趨于穩(wěn)定。

圖3 不同作用時(shí)間對(duì)L01黏附于Caco-2的影響Fig.3 The effect of different incubating times on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

2.4 環(huán)境pH對(duì)黏附作用的影響

用 pH 分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 的緩沖液將植物乳桿菌濃度調(diào)整為1×108CFU/mL后進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4所示。

圖4 pH對(duì)L01黏附于Caco-2的影響Fig.4 The effect of different environmental pH on the adherence of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

根據(jù)T檢驗(yàn)分析可知，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境pH處于3～6之間時(shí)，隨著pH的升高黏附的細(xì)菌數(shù)有顯著的增加(P＜0.01);當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境pH達(dá)到6.0之后，黏附的細(xì)菌數(shù)趨于飽和，并且在培養(yǎng)環(huán)境pH為6.0～8.0時(shí)，細(xì)菌黏附數(shù)無顯著變化(P＞0.05)。當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境pH達(dá)到9.0時(shí)，此時(shí)黏附的細(xì)菌數(shù)出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(P＜0.01)?？梢缘贸?培養(yǎng)環(huán)境的pH低于6.0時(shí)，黏附的細(xì)菌數(shù)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境pH有一定的依賴性。然而當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境的pH高于8.0時(shí)，黏附細(xì)菌數(shù)明顯下降。由此可以看出，弱酸環(huán)境更有利于植物乳桿菌L0的黏附過程的發(fā)生。與陳臣［11］研究得出的中性環(huán)境更利于黏附的發(fā)生有所不同，這可能是酸性環(huán)境改變Caco-2細(xì)胞表面的某些理化性質(zhì)，導(dǎo)致菌體與細(xì)胞黏附作用增強(qiáng)，從而使更多的植物乳桿菌L01黏附到Caco-2細(xì)胞表面上，并且不易脫落;另一方面，這可能是菌體之間的差異性造成的結(jié)果，植物乳桿菌L01具有更好的耐酸性。

2.5 單糖種類對(duì)黏附性的影響

在細(xì)菌懸浮液中分別加入D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甲基-α-D-甘露糖苷(終濃度為100 mmol/L)，空白對(duì)照組加入等量的PBS緩沖液，進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5可知，當(dāng)加入4種不同的單糖時(shí)，甲基-α-D-甘露糖苷(P ＜0.01)，D-甘露糖(P ＜0.01)均能顯著抑制植物乳桿菌L01對(duì)Caco-2的黏附作用，黏附的細(xì)菌數(shù)有了明顯的減少。另外兩種單糖D-葡萄糖(P ＞0.05)，D-半乳糖(P ＞0.05)均不能抑制其黏附作用。分析FERREIRA［12］在2011年研究得出的細(xì)菌的黏附能力與菌體表面性質(zhì)存在較大相關(guān)性的結(jié)論，同時(shí)參考 GARCíA-CAYUELA T［13］的關(guān)于黏附涉及蛋白質(zhì)、糖脂和單糖等黏附素特異性黏附的研究，可以推測(cè)得知由于甘露糖及其衍生物與乳桿菌細(xì)胞壁中含多糖表面的糖基部分相似，代替乳桿菌與細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的，故導(dǎo)致了細(xì)菌的黏附數(shù)明顯下降。

圖5 單糖對(duì)植物乳桿菌L01黏附于Caco-2的影響Fig.5 The effect of different monosaccharide on the adherence of of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

2.6 二價(jià)金屬離子對(duì)黏附作用的影響

在濃度調(diào)整為1×108CFU/mL的L01菌懸液中分別加入CaCl2和 MgCl2，使其終濃度分別為0，5，10，15，20 mmol/L，然后進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6所示。由圖6可知，隨著金屬離子濃度的升高，黏附的細(xì)菌數(shù)無明顯變化(P＞0.05)。此結(jié)果說明Ca2+和Mg2+這兩種金屬離子并未參與到植物乳桿菌L01黏附過程。Crow等［14］人曾研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌與細(xì)胞表面的靜電相互作用是兩者的初步結(jié)合，金屬離子Ca2+、Mg2+會(huì)參與到此黏附過程。但是本實(shí)驗(yàn)并未得到與其一致的結(jié)論。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，Ca2+、Mg2+的加入對(duì)黏附作用無顯著影響(P＞0.05)。REN［15］的研究曾指出，乳酸菌的疏水性與其黏附作用存在一定的相關(guān)性，由此我們可以推測(cè)得知植物乳桿菌L01在與Caco-2的黏附過程的結(jié)合先是疏水作用，之后才是表面黏附素與受體結(jié)合［13］。故Ca2+、Mg2+并未參與植物乳桿菌L01的黏附。

圖6 二價(jià)金屬離子對(duì)植物乳桿菌L01黏附于Caco-2的影響Fig.6 The effect of different ion concentrations on the adherence of of L.plantnum L01 on Caco-2 cells

3 結(jié)論

本文考察了菌體濃度、菌體生長(zhǎng)階段、pH、作用時(shí)間、金屬離子以及單糖種類等六種因素對(duì)植物乳桿菌L01黏附Caco-2細(xì)胞的性能的影響。結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到1×108CFU/mL、孵育2 h時(shí)，黏附趨于飽和。穩(wěn)定期的植物乳桿菌L01對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附效果最好。植物乳桿菌L01在弱酸偏中性范圍黏附性最強(qiáng);考察4種單糖對(duì)植物乳桿菌L01黏附抑制作用發(fā)現(xiàn)，甲基-α-D-甘露糖苷，D-甘露糖均能顯著抑制植物其黏附作用，D-葡萄糖、D-半乳糖均無明顯變化。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Mg2+并未對(duì)植物乳桿菌L01黏附于Caco-2細(xì)胞造成顯著影響，說明Ca2+、Mg2+并未參與植物乳桿菌L01的黏附過程，植物乳桿菌L01與Caco-2的初步結(jié)合并非靜電相互作用導(dǎo)致，而是由疏水相互作用引起的。

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