周偉娥，張元，李偉青，李紹輝，蔣受軍，李紅娜，鄭陽，張峰

1(中國檢驗檢疫科學研究院 食品所，北京，100176)

2(廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧，530299)

3(廣西藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心，廣西南寧，530022)

隨著生活水平的提高，畜牧業(yè)的發(fā)展，獸藥的使用越來越廣泛。畜禽使用獸藥后，獸藥及其毒性代謝物易蓄積于動物體內(nèi)，并隨著食物鏈的傳遞，進入人體，蓄積于體內(nèi)的獸藥殘留會威脅人類健康，因此食品中獸藥殘留的問題日益受到關(guān)注［1-2］。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素作為獸藥中重要一員，在臨床及獸藥領(lǐng)域均得到廣泛使用［3-5］。該類藥物不可逆的結(jié)合到細菌核糖體50S亞基上，阻斷轉(zhuǎn)肽及mRNA位移，選擇性抑制蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮抗菌作用［6］。該藥常用于治療上呼吸道感染、泌尿道感染和畜禽胃腸道感染等，少量使用能促進畜禽生長［7-9］。但該藥毒副作用多見，易造成胃腸道反應(yīng)，肝腎損傷、耳蝸神經(jīng)受損、嚴重者可導(dǎo)致各種慢性中毒或“三致”等危害［10］。為保障食品安全，歐盟委員會和我國農(nóng)業(yè)部235號公告都對食用性組織中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的最大殘留限量作出了規(guī)定，如表1示。因此，建立高效、簡便的檢測分析方法以嚴格控制動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留是極其必要的。

截至目前，動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測方法研究較多，本文綜述了國內(nèi)外近10年的動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測技術(shù)相關(guān)文獻，擬為進一步研究和開發(fā)快速、簡便、高通量方法提供依據(jù)。

1 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測研究現(xiàn)狀

目前在pudmed數(shù)據(jù)庫中，以macrolide為檢索詞，一共檢索出92 789篇，近5年約占20%，determination of macrolide為檢索詞，一共檢出29 690篇(約占總數(shù)的32%)，近5年約占了22%，如圖1所示。而在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中，以大環(huán)內(nèi)酯為全文檢索，一共檢索出18 939篇，近5年約占47%，其中以大環(huán)內(nèi)酯殘留檢測為全文檢索，一共檢索出文獻1 411篇(約占總數(shù)的7.5%)，近5年約占50%，如圖2所示?？傮w來說，近10年國內(nèi)外對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究都有明顯的上升，近5年國內(nèi)外有關(guān)大環(huán)內(nèi)酯類藥物研究的文獻比例都較高，而近5年內(nèi)我國對于大環(huán)內(nèi)酯的殘留檢測研究比例比國外少得多，所以需要進一步加大對食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留檢測以保證食品安全，需要深入研究食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留檢測技術(shù)。

表1 歐盟委員會(EC)和我國(CHA)農(nóng)業(yè)部235號公告中大環(huán)內(nèi)酯類藥物在食用組織中的最大殘留限量規(guī)定Table 1 The maximum residue limit in edible tissue were regulated by European Commissio and China

圖1 Pudmed數(shù)據(jù)庫文獻統(tǒng)計情況Fig.1 Pudmed database literature statistics

圖2 中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫文獻統(tǒng)計情況Fig.2 CNKI database literature statistics

2 藥物理化性質(zhì)

大環(huán)內(nèi)酯類藥物基本化學結(jié)構(gòu)是由14～16元大內(nèi)酯環(huán)與1～3個去氧氨基糖或者二甲氨基糖通過羥基縮合成的堿性苷。該藥多數(shù)為弱堿性親酯類化合物，一般易溶于極性有機溶劑如甲醇、乙腈等，微溶于水和弱極性溶劑［14］。該藥氨基糖結(jié)構(gòu)的叔胺基在酸性溶液中可離子化，使其在酸性溶液中有一定的溶解度，但其在強酸強堿中穩(wěn)定性較差。當溶液pH ＜4.0時，大環(huán)內(nèi)酯類藥物的糖苷鍵可能水解，當溶液pH ＞9時，內(nèi)酯環(huán)易開裂，因此一般采用偏中性(pH 6～8)的極性有機溶液中溶解［15-16］。

3 前處理方法

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在各種動物源性食品中均有殘留，如肉類、內(nèi)臟、動物奶及其制品、禽蛋和蜂蜜等［17-20］。樣品前處理是為了在各種復(fù)雜食品基質(zhì)中最大限度的提取、分離、凈化和富集藥物，以便于儀器檢測［21］。但由于食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留水平較低，基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，加大了凈化的難度［22-23］，所以需要尋找一個選擇性強、操作簡單、回收率高而穩(wěn)定的前處理方法，以解決食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測問題。目前，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素前處理方法可分為傳統(tǒng)前處理方法和新型前處理方法。傳統(tǒng)前處理方法包括溶劑萃取或液液萃取等方式。新型技術(shù)前處理方法包括固相萃取、加壓液體萃取、中空纖維液相微萃取、基質(zhì)固相分散萃取等。前處理方法各有優(yōu)缺點，需要根據(jù)研究的樣品性質(zhì)和待測物性質(zhì)選擇合適的前處理方法。

3.1 傳統(tǒng)前處理方法

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的傳統(tǒng)前處理方法是溶劑提取或液液萃?。?4-25］。溶劑提取一般過程是將樣品勻漿處理后，選擇極性有機溶劑萃取，在提取過程中，為了提高萃取效率，水浴、超聲、微波或振蕩等輔助措施均常被采用［26-27］，如林潔等［28］采用體積分數(shù)20%甲醇水溶液提取蜂蜜中的10種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，用2 mmol/L乙酸銨水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值，利用渦旋、超聲、水浴等輔助提取，回收率可達94% ～115%。甲醇和乙腈是大環(huán)內(nèi)酯類藥物最常用的提取溶劑［25，29］。劉曄等［30］在豬肝中比較了甲醇、乙腈、甲醇-水、甲醇-偏磷酸等提取溶液，發(fā)現(xiàn)甲醇對4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的提取效率最高。蘇秀華等［31］在水產(chǎn)品中考察了乙腈、甲醇、酸化乙腈、偏磷酸-甲醇和乙酸乙酯等提取溶劑，發(fā)現(xiàn)乙腈對替米考星的提取效率最高。由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在酸性條件下有質(zhì)子化傾向，容易向水相轉(zhuǎn)移，有學者認為酸化溶劑更有利于提取，張園等［32］在水產(chǎn)品中對比了甲醇、乙腈和1%的酸化乙腈溶液，認為酸化乙腈溶液對泰樂菌素的提取效率最高。也有學者在堿性條件下提取［33-35］，但回收率不理想，限制了其的使用，徐錦忠等［35］用NaCO3/NaHCO3緩沖液提取蜂蜜中8種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，回收率達60% ～130%。

食品中多含有脂肪和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，因此在檢測前需要進行除脂、沉淀蛋白等除雜過程［36-37］，液液萃取是一種常見的大環(huán)內(nèi)酯類藥物凈化方式。液液萃取法主要基于被測物與雜質(zhì)在不同溶劑間的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)提取分離凈化。正己烷是常用的萃取溶劑之一［38-39］。張崇威等［40］采用 V(乙腈)∶V(水)=15∶2提取，正己烷液液萃取凈化，UPLC-MS/MS檢測豬肉、雞肉和雞蛋中7種獸藥殘留(包括3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素)，3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測限為0.5 μg/kg，回收率達80% ～100%。傳統(tǒng)前處理方法不需要特殊儀器設(shè)備，儀器成本低，操作簡單，但是繁瑣費時，有機溶劑消耗量大，不利于安全環(huán)保，且共萃取雜質(zhì)較多，增加了凈化的工作量和難度。

3.2 高新技術(shù)前處理方法

3.2.1 固相萃取法(SPE法)

固相萃取(SPE)是大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測中最為常用的一種前處理方法［29-34］。其利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，盡量少吸附或不吸附樣品基質(zhì)及干擾化合物，再通過洗脫液將目標物洗脫收集而達到分離純化和富集的目的。根據(jù)固相萃取柱的作用機制可分為正相柱、反相柱、離子交換柱、吸附柱和混合柱如Bond Elut Plexa和Oasis HLB等。而大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留樣品均可用上述5種固相萃取柱凈化［29-34］，其中用的比較廣泛的是C18柱和HLB柱［41-42］。固相萃取法一般與溶劑萃取相結(jié)合運用。Mi等［42］用體積分數(shù)70%的乙腈溶液提取魚肉或蝦肉中7種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留，并加入硅藻土吸附雜質(zhì)，加入NaCl利于分層，還用正己烷除去脂肪后再用HLB柱凈化，回收率達68% ～85%。林維宣等［43］采用甲醇提取腸衣中7種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留量，水浴減壓濃縮后用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，復(fù)溶液用固相萃取柱凈化，實驗對比了 C18、Oasis(HLB)和MCX的凈化效果，結(jié)果顯示Oasis(HLB)回收率較理想，可達70.9% ～98.4%。該法操作簡便，快速，減少不必要的工序，凈化效果比液液萃取提高很多，且便于自動化。

3.2.2 加壓液體萃取(PLE)

加壓溶劑萃取通過提高萃取溫度和壓力，大大降低范德華力、氫鍵、偶極等作用，從而減弱基質(zhì)對分析成分的吸附作用，提高對分析成分的溶解能力。該方法具有萃取迅速、自動化程度高，萃取劑使用較少，經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)勢，在食品中大環(huán)內(nèi)酯殘留測定中多有應(yīng)用［44-46］，如 Houda等［47］采用 PLE 法萃取魚和肉中 7種大環(huán)內(nèi)酯的殘留，回收率達77%以上，效果令人滿意。

3.2.3 中空纖維液相微萃取(HF-LPME)

HF-LPME是近年發(fā)展而來集采樣、萃取、濃縮于一體的前處理新技術(shù)。具有操作簡便、易于實現(xiàn)自動化，可與GC和HPLC聯(lián)用等優(yōu)點，可應(yīng)用于藥物的檢測［47-48］，此法也可應(yīng)用于食品中大環(huán)內(nèi)酯的殘留檢測。劉志梅等［49］用聚丙烯中空纖維在磁力攪拌器作用下對pH=8.5的牛奶樣品溶液進行萃取，氮吹干后用乙腈溶解后色譜分析，3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物回收率達79% ～105.3%，整個過程簡便、快速。但HFLPME應(yīng)用于動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的相關(guān)研究較少，還有待進一步的比較研究。

3.2.4 基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)(MSPDE)

基質(zhì)固相分散萃取(MSPDE)是在SPE的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。其原理是試樣與SPE分散劑填料一起研磨混合均勻成半固態(tài)混合物，裝入空的SPE柱，再用溶劑淋洗除雜，然后收集含有待測組分的洗脫液，供檢測用。由于其凈化所需的樣品和溶劑量都較少，操作簡便快捷，能與其他萃取方法相結(jié)合，在食品中大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留檢測中有所應(yīng)用。Mayor等［50］采用MSPDE測定綿羊奶中7種大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留，回收率達74%～97%。

3.2.5 其他前處理方法

支撐液膜萃取是一種新型萃取技術(shù)，利用膜溶劑在惰性的多孔液膜支撐體上形成支撐液膜對樣品進行分離和凈化。液膜可承受較大壓力，具有高選擇、高分離能力、高通量和有機溶劑用量少等優(yōu)點。Msagati等［51］在2004年首次利用支撐液膜萃取技術(shù)分離3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物。除此之外，QuEChERS方法是集提取、分離、凈化于一體的方法，最初應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中，也逐漸應(yīng)用于獸藥殘留中［52］，而在食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物應(yīng)用較少。目前，胡鳳楊等［53］利用QuECh-ERS技術(shù)處理蔬菜中的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，回收率在51.6% ～98.7%。

4 檢測分析方法

4.1 微生物法

在抗生素檢測中，微生物法屬于經(jīng)典的含量檢測方法。微生物法是根據(jù)抗生素對該藥敏感微生物的抑菌圈大小與抗生素濃度呈線性相關(guān)來定量檢測的。如黃曉蓉等［54］應(yīng)用微生物法篩查肉類、水產(chǎn)品和蛋內(nèi)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。但是微生物法選擇不同的生產(chǎn)菌種，不同的生產(chǎn)廠家，易造成組分比例不同，使得微生物效價的測定差別加大，難以滿足準確定性定量的要求，而逐漸被取代。

4.2 薄層色譜法(TLC法)

TLC法利用薄層板和各種有機溶劑在固液吸附色譜過程中將樣品組分分離和顯色，用薄層掃描法測定含量。該法可以通過變換不同的溶劑、顯色劑和檢測方式測定批量樣品，成本低，設(shè)備與操作簡單。Petz等［55］用pH=8.5的乙腈水溶液提取動物組織、奶、和蛋中的4種大環(huán)內(nèi)酯后用TLC分離鑒定。但是TLC法分離能力較差，對復(fù)雜樣品的的鑒定能力不足，靈敏度較低，不利于準確定量分析而逐漸減少應(yīng)用。

4.3 紫外分光光度法(UV法)

紫外分光光度法是根據(jù)被測物質(zhì)在特定波長內(nèi)有吸收，其吸光度與濃度成正比的定律，對該物質(zhì)進行定性定量。部分大環(huán)內(nèi)酯類藥物如螺旋霉素、吉他霉素、替米考星等含有α，β-不飽和酮，在200～300 nm處有紫外吸收的光譜特征，可以應(yīng)用紫外分光光度法檢測。UV法儀器成本低，操作簡單，如 Riedl等［56］用甲醇提取樣品中納他霉素，用UV法測定其含量。但是其檢測結(jié)果容易受樣品中雜質(zhì)的影響，對前處理的要求高，只適合檢測較純的物質(zhì)，所以目前在大環(huán)內(nèi)酯類中沒能廣泛使用。

4.4 毛細管電泳-電化學檢測方法(CE-ECL)

毛細管電泳(CE)是利用高壓電場在毛細管中將少量樣品進行快速、高效分離分析，但檢測靈敏度較低，而電化學檢測靈敏度高，線性范圍寬，克服了CE的弱點，兩者的結(jié)合能夠高分離能力高靈敏度的測定復(fù)雜樣品，因此在測定大環(huán)內(nèi)酯藥物中受到青睞［57-59］，如史艷梅［60］采用 CE-ECL 測定牛奶中 3 種大環(huán)內(nèi)酯藥物，檢測限為3.2×10-7mol/L，但是多數(shù)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的氧化電位較高，易受到流動相和樣品基質(zhì)中還原性物質(zhì)的干擾，因而電化學檢測器不易推廣。

4.5 氣相色譜法(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)

氣相色譜法具有靈敏度高、專屬性好等特點，適用于揮發(fā)性高、熱穩(wěn)定性較好、極性較高的化合物。若大環(huán)內(nèi)酯類要應(yīng)用GC法測定，需要將其衍生化，讓其適合GC定量檢測，如Keigo等［61］將吉他霉素、螺旋霉素和泰樂菌素衍生化后用GC-MS測定其含量。尋找衍生化方法過程漫長且衍生化步驟繁雜，所以無疑限制大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的GC法和GC-MS法的應(yīng)用。

4.6 高效液相色譜法(HPLC法)

高效液相色譜法是利用被測組分在2項中吸附或分配系數(shù)的微小差異而達到分離的目的，加上與紫外-可見檢測器或熒光檢測器相結(jié)合，能夠同時準確的檢測大量的組分。該法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測速度快，線性范圍寬等特點，同時能夠克服GC法缺點，適合分析沸點高、熱穩(wěn)定性較差、分子質(zhì)量大的化合物。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素大多難于氣化或衍生，且相當一部分具有紫外吸收，所以該法廣泛應(yīng)用于食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測。邢麗紅等［62］采用高效液相色譜-熒光檢測法測定鱸魚組織中阿維菌素、伊維菌素。Masakazu等［63］采用0.3%V(偏磷酸)∶V(甲醇溶液)=7∶3提取，ElutSCX(500 mg)固相萃取柱凈化，高效液相色譜-紫外檢測法測定肉中5種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留，檢測限可達0.05 μg/g，檢測快速、準確、重現(xiàn)性好，但是還不能完全滿足低殘留的檢測需要。

4.7 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS和 LC-MS/MS)

與HPLC法相比，LC-MS的檢測器是質(zhì)譜檢測器。質(zhì)譜遵循帶電粒子磁場或電場中的運動規(guī)律，利用化合物的質(zhì)荷比實現(xiàn)分離和利用豐度比實現(xiàn)定量，集高分離能力、高靈敏度、高分辨率于一體，是目前認為最佳的分析方法用于動物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測［64-66］。Tao等［65］用 LC-MS 同時測定肉中17種大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留，線性范圍在2～400 μg/kg之間，檢出限在0.55 μg/kg，回收率在75%以上。劉永濤等［27］用 LC-MS/MS測定水產(chǎn)品中5種大環(huán)內(nèi)酯，檢測限達1.0 μg/kg，在 1 ～ 100 μg/kg 的線性范圍，回收率達67.52% ～108.89%，分離與檢測都取得良好效果，適合食品中大環(huán)內(nèi)酯藥物殘留的痕量檢測。但是質(zhì)譜分析的儀器比較昂貴，對操作人員要求較高，在基層檢測中還有待進一步推廣。

5 展望

在過去的10年，無論是在畜禽還是水產(chǎn)等動物源性食品中，大環(huán)內(nèi)酯類藥物不同的前處理方法和檢測方法都相應(yīng)被開發(fā)出，而研究的重點和熱點主要集中在前處理方法的開發(fā)。但是截止到目前，動物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測的前處理開發(fā)的方法主要集中于SPE，而在其他獸藥殘留中常用的方法如固相微萃取技術(shù)、液相微萃取技術(shù)、QuEChERs方法等［67-69］在動物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物中研究較少，有待進一步開發(fā)。目前，分析檢測研究趨勢是向高分離度、高準確度、高靈敏度、高分辨率發(fā)展，食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測也主要應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。高分辨飛行時間質(zhì)譜或軌道阱質(zhì)譜儀具有較強大的多殘留篩查能力，有待進一步的應(yīng)用。處理裝置小，處理速度快，操作簡單化，樣品和有機溶劑用量少，對待測成分的選擇性和回收率高，易于自動化的前處理方法與高分離度、高準確度、高靈敏度、高分辨率的分析儀器的相結(jié)合應(yīng)用必將得到更大的發(fā)展，以滿足獸藥殘留檢測的需要。

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