王紅波， 陳禪友， 劉 潔， 童 佩， 李 碩

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430056；2.武漢回盛生物科技有限公司，湖北省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430042）

糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）也稱糞腸球菌，為乳酸菌中的一類，屬于鏈球菌科，腸球菌屬，細(xì)胞呈球形，兼性厭氧，是革蘭氏陽(yáng)性菌（Franz等，2011）。糞鏈球菌作為益生菌，在動(dòng)物的生產(chǎn)中應(yīng)用效果良好，可提高動(dòng)物機(jī)體的抗體水平，強(qiáng)化巨噬細(xì)胞的活力，提高免疫能力，促進(jìn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖（Liu 等，2014；Swain 等，2009）。 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，糞鏈球菌有利于提高飼料的利用率，降低飼養(yǎng)成本，改善飼養(yǎng)環(huán)境。糞鏈球菌為兼性厭氧的乳酸菌，需氧量低，降低水體富營(yíng)養(yǎng)的能力強(qiáng)，改善水質(zhì)的功效良好。目前用搖瓶發(fā)酵優(yōu)化糞鏈球菌培養(yǎng)條件的研究報(bào)道較多，但用生物反應(yīng)器高效制備糞鏈球菌的發(fā)酵調(diào)控研究報(bào)道較少，搖瓶培養(yǎng)與生物反應(yīng)器培養(yǎng)差異大，產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模低成本發(fā)酵生產(chǎn)的難度大。溶氧和pH是發(fā)酵調(diào)控的兩個(gè)關(guān)鍵因素，糞鏈球菌耗氧量低，溶氧易控制。因此試驗(yàn)研究了用生物反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)糞鏈球菌的pH調(diào)控策略，為大規(guī)模高效發(fā)酵生產(chǎn)糞鏈球菌提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種 糞鏈球菌，由江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保藏和提供。

1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%、酵母浸粉1.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、檸檬酸氫二銨0.2%、乙酸鈉0.4%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、瓊脂粉2.0%，pH值7.0。

種子培養(yǎng)基：蔗糖2.5%、酵母浸粉2.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、磷酸氫二鈉0.1%、檸檬酸氫二銨0.1%、硫酸鎂0.05%、硫酸錳0.005%、吐溫-80 0.1%、碳酸鈣0.8%，初始pH值8.0，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖3.0%、酵母浸粉1.5%、牛肉膏1.5%、蛋白胨1.0%、乙酸鈉0.6%、磷酸氫二鉀0.1%、磷酸氫二鈉0.1%、檸檬酸氫二銨0.3%、硫酸鎂0.05%、硫酸錳0.005%、吐溫-80 0.1%、乳化硅油0.2%、碳酸鈣0.8%，初始pH值8.0，121℃滅菌30 min。

以上三種培養(yǎng)基組成均在Liu等（2014）和莫海燕等（2013）的研究基礎(chǔ)上經(jīng)過進(jìn)一步發(fā)酵優(yōu)化研究而得出。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化 將保存于甘油管的菌種稀釋后涂布于培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.2 種子液制備 用3 mL無菌水從培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上洗下菌落，取1 mL菌液接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、150 r/min培養(yǎng)15 h，獲得種子液。

1.3.3 生物反應(yīng)器發(fā)酵培養(yǎng) 按6%的接種量將種子液接入裝有6 L發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中，37℃，通氣量0.4 VVM，攪拌轉(zhuǎn)速200～300 r/min，流加5 mol/L NaOH溶液對(duì)發(fā)酵液的pH進(jìn)行調(diào)控。

1.3.4 pH測(cè)定 使用pH電極測(cè)定。

1.3.5 發(fā)酵液中蔗糖濃度測(cè)定 取1 mL發(fā)酵液8000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定蔗糖的濃度，檢測(cè)3個(gè)平行樣品。蔗糖含量測(cè)定參考李利軍等（2003）的紫外分光光度法。

1.3.6 活菌量 將發(fā)酵液按 106、107、1083個(gè)梯度進(jìn)行稀釋，取0.1 mL稀釋后的發(fā)酵液涂布于培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基，每梯度重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng) 48 h，計(jì)數(shù)活菌數(shù)（cfu/mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對(duì)糞鏈球菌生長(zhǎng)的影響 糞鏈球菌在不同的恒定pH環(huán)境（5.7～7.8）下發(fā)酵17 h，對(duì)比發(fā)酵液中糞鏈球菌的活菌數(shù)。研究結(jié)果表明，pH為6.6最有利于糞鏈球菌的生長(zhǎng)。Liu等（2014）運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化的方法優(yōu)化得出糞鏈球菌發(fā)酵液最佳的pH為6.7。pH低于6.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)受到抑制，生物量降低。6.3～7.5是菌體合適的pH范圍，菌體生長(zhǎng)良好，發(fā)酵液活菌數(shù)較高。pH為7.8時(shí)發(fā)酵液中活菌數(shù)降低，但降幅較小（圖1）。發(fā)酵前期需要流加NaOH溶液中和糞鏈球菌生成的乳酸，而乳酸鈉為強(qiáng)堿弱酸鹽，水解后顯堿性，為了控制恒定的發(fā)酵液pH，發(fā)酵后期需流加酸性溶液中和堿性。由于糞鏈球菌在pH 6.3～7.8生長(zhǎng)差異不明顯，為了操作簡(jiǎn)便、成本低廉、環(huán)境友好，只需調(diào)控發(fā)酵液的pH在6.3～7.8即可。

圖1 pH對(duì)糞鏈球菌生長(zhǎng)的影響

2.2 pH調(diào)控與非調(diào)控對(duì)發(fā)酵液pH及NaOH溶液殘留量的影響 糞鏈球菌在pH非調(diào)控的自然條件下發(fā)酵生長(zhǎng)，發(fā)酵前10 h，乳酸快速合成，pH下降明顯；發(fā)酵10 h后，發(fā)酵液pH下降至4.67，發(fā)酵液pH趨于穩(wěn)定。配制5 mol/L的NaOH溶液200 mL，中和發(fā)酵液中糞鏈球菌生成的乳酸，調(diào)控發(fā)酵液的pH為6.3～7.8。糞鏈球菌在pH調(diào)控的條件下發(fā)酵生長(zhǎng)，當(dāng)發(fā)酵液pH低于6.3時(shí)，流加NaOH溶液，控制pH為6.3～7.8。發(fā)酵1 h后開始流加NaOH溶液中和乳酸，發(fā)酵9 h后停止添加，發(fā)酵前5 h流加速率逐漸增加，發(fā)酵后4 h流加速率逐漸降低，表明菌體乳酸的合成能力在發(fā)酵4 h后達(dá)到最大值。發(fā)酵9～20 h，發(fā)酵液pH從6.49上升至8.33，此過程無需調(diào)控發(fā)酵液的pH。發(fā)酵液pH的升高可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵后期，糞鏈球菌的乳酸合成能力逐漸下降，新合成的乳酸少，且乳酸鈉水解顯堿性使發(fā)酵液的pH升高。糞鏈球菌生產(chǎn)只需在發(fā)酵前期（前9 h）流加NaOH溶液，使發(fā)酵液的pH維持在6.3～7.8，菌體生長(zhǎng)良好（圖2a、b）。

圖2 pH調(diào)控與非調(diào)控對(duì)發(fā)酵液pH（a）及NaOH溶液殘留量（b）的影響

2.3 pH調(diào)控與非調(diào)控對(duì)發(fā)酵液溶氧的影響及攪拌轉(zhuǎn)速的變化規(guī)律 溶氧（DO）與通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速和菌體耗氧能力密切相關(guān)。在通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速恒定的情況下，溶氧水平能反映糞鏈球菌的耗氧能力。pH非調(diào)控，發(fā)酵前6 h，攪拌轉(zhuǎn)速恒定于200 r/min，發(fā)酵液溶氧從83%下降到54.3%。為了使碳酸鈣與乳酸充分混合，中和乳酸，發(fā)酵6 h后攪拌轉(zhuǎn)速緩慢提升至250 r/min，溶解氧逐步上升至79.7%；發(fā)酵7～10 h過程中，溶氧緩慢下降；發(fā)酵10～20 h時(shí)，溶氧緩慢上升，菌體耗氧能力下降。pH調(diào)控發(fā)酵生產(chǎn)糞鏈球菌，發(fā)酵前3 h，轉(zhuǎn)速恒定于200 r/min，發(fā)酵前3 h發(fā)酵液溶氧從85.7%快速下降至20.9%；發(fā)酵3 h后，攪拌轉(zhuǎn)速緩慢提升至250 r/min，發(fā)酵7 h后，攪拌轉(zhuǎn)速緩慢提高至300 r/min。發(fā)酵10 h后，發(fā)酵液的溶解氧開始緩慢上升，表明菌體耗氧能力下降，菌體生長(zhǎng)速率下降。研究結(jié)果表明，控制發(fā)酵液的pH為6.3～7.8，能降低發(fā)酵液的溶氧，增加菌體的耗氧量，有利于菌體生長(zhǎng)（圖 3a、b）。

2.4 pH控制與非調(diào)控對(duì)蔗糖代謝的影響 Rea和Cogan（2003）研究表明，培養(yǎng)基中葡萄糖和果糖能抑制糞鏈球菌對(duì)檸檬酸鹽的代謝，而蔗糖和半乳糖對(duì)檸檬酸鹽的代謝無抑制作用。同時(shí)蔗糖相對(duì)于葡萄糖為緩釋碳源，能降低乳酸的合成速率，有利于糞鏈球菌的生長(zhǎng)。因此，本研究用蔗糖取代葡萄糖，作為發(fā)酵生產(chǎn)糞鏈球菌的碳源。發(fā)酵過程pH非調(diào)控時(shí)，發(fā)酵前16 h，蔗糖的平均代謝速率為1.23 g/L·h。發(fā)酵前12 h蔗糖的代謝速率快，主要滿足于菌體的生長(zhǎng)；發(fā)酵12 h后蔗糖代謝速率開始降低，主要滿足于菌體自身生存的需要。發(fā)酵過程pH調(diào)控時(shí)，發(fā)酵前16 h，蔗糖的平均代謝速率為1.48 g/L·h，菌體生長(zhǎng)快速；發(fā)酵16 h后，蔗糖分解速率開始降低，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，能量需求下降（圖4a）。

圖3 pH調(diào)控與非調(diào)控對(duì)發(fā)酵液溶氧的影響（a）及攪拌轉(zhuǎn)速的變化規(guī)律（b）

圖4 pH調(diào)控與非調(diào)控對(duì)蔗糖代謝（a）及發(fā)酵液活菌數(shù)（b）的影響

2.5 pH調(diào)控與非調(diào)控對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響pH是菌體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，不調(diào)控發(fā)酵液的pH，隨著pH的降低，菌體細(xì)胞的耗氧能力下降，蔗糖代謝的能力下降，發(fā)酵10 h，pH降至4.67，菌體生長(zhǎng)受到抑制。發(fā)酵14 h后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵液中活菌數(shù)為4.4×109cfu/mL。莫海燕等（2013）研究表明，糞鏈球菌達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間為18～20 h。調(diào)控發(fā)酵液的pH維持在6.3～7.8，能提高菌體細(xì)胞的活力，增加菌體的蔗糖代謝能力和耗氧能力，提高了菌體的生長(zhǎng)速率，延長(zhǎng)了菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵16 h后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵液的活菌數(shù)達(dá)到7.3×109cfu/mL（圖4b）?？梢?，調(diào)控發(fā)酵液的pH，發(fā)酵液的活菌數(shù)提高了65.9%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，pH低于4.67時(shí)，糞鏈球菌生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)入衰老期。發(fā)酵1～9 h，流加NaOH溶液，調(diào)控發(fā)酵液的pH于區(qū)間為6.3～7.8，能增加發(fā)酵液中糞鏈球菌活菌數(shù)，較非調(diào)控提高65.9%。采用該pH調(diào)控方法發(fā)酵生產(chǎn)糞鏈球菌，效果良好、成本低廉、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。

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