燕曉翠， 劉西周， 涂苑楠， 孟繁瑞， 馬 蕊， 郭成金， 范 寰*

（1.天津師范大學，天津西青 300387；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津西青 300384）

木質(zhì)素是構(gòu)成植物細胞壁的主要成分，嚴重影響動物對植物性飼料的消化。白腐真菌是迄今發(fā)現(xiàn)降解木質(zhì)素最有效的微生物，但其在自然狀態(tài)下定植緩慢，要求的發(fā)酵條件較嚴格，目前大多數(shù)的研究還僅限于實驗室（范寰等，2009）。細胞電融合是一種細胞工程技術，與傳統(tǒng)的病毒或化學溶劑介導的細胞融合相比，電融合法具有條件易控、無細胞毒害與污染、細胞損傷小、適用范圍廣、融合率高以及過程可見等優(yōu)點。本研究選用白腐真菌中有很強木質(zhì)素降解能力的糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）和生長速度快，代謝產(chǎn)物有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、B族維生素和礦物質(zhì)的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的原生質(zhì)體為親本，通過篩選最佳的電融合條件，構(gòu)建一種兼具兩親本的優(yōu)良特性，可有效降解植物性飼料中木質(zhì)素和改善其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 糙皮側(cè)耳595（Pleurotus ostreatus），天津市畜牧獸醫(yī)研究所飼料微生物實驗室保藏。釀酒酵母 SC（Saccharomyces cerevisiae），天津市畜牧獸醫(yī)研究所飼料微生物實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 糙皮側(cè)耳液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉 2 g/L，麥麩（浸提液）15 g/L，蔗糖15 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，維生素 B14 mg/L。

糙皮側(cè)耳固體再生培養(yǎng)基：側(cè)耳液體培養(yǎng)基加入硫酸鎂（0.6 mol/L）和瓊脂（20 g/L）。

釀酒酵母液體培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉 10 g/L。

釀酒酵母固體再生培養(yǎng)基：酵母液體培養(yǎng)基加入山梨醇（0.6 mol/L）和瓊脂（20 g/L）。

綜合培養(yǎng)基：土豆200 g/L，棉籽皮200 g/L，葡萄糖 20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，維生素 B14 mg/L、瓊脂 18 g/L。

1.1.3 滲穩(wěn)劑 糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體制備滲穩(wěn)劑：用去離子水將硫酸鎂配成0.6 mol/L質(zhì)量濃度溶液，滅菌后備用。

釀酒酵母原生質(zhì)體制備滲穩(wěn)劑：用去離子水將蔗糖配成0.6 mol/L質(zhì)量濃度溶液，滅菌后備用。

電融合滲穩(wěn)劑：甘露醇（以0.1mmol/L氯化鈣為溶劑）配成0.6 mol/L質(zhì)量濃度溶液，滅菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備與再生 糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體和釀酒酵母原生質(zhì)體的制備與再生分別參照涂苑楠等（2013）和馬恒德（2012）的方法。

1.2.2 親本滅活

1.2.2.1 側(cè)耳原生質(zhì)體熱滅活 參照燕曉翠等（2015）的方法，將純化后的側(cè)耳原生質(zhì)體調(diào)整為105個/mL，于60℃、恒溫水浴中滅活10 min。

1.2.2.2 啤酒酵母原生質(zhì)體紫外滅活 參照燕曉翠等（2015）的方法，將啤酒酵母原生質(zhì)體純化后稀釋到105個/mL，在距15 W紫外燈下20 cm處垂直照射230 s。

1.2.3 雙親融合正交試驗 利用寧波新芝生物儀器公司生產(chǎn)的NCY-3型細胞電融合儀，按照設計的L16（45）融合正交試驗，測定交變電壓、交變電場頻率、脈沖場強、脈沖個數(shù)和脈沖間隔對雙親菌株原生質(zhì)體融合率的影響，試驗設計見表1。

表1 電融合試驗因素和水平

將兩親本原生質(zhì)體溶液濃度調(diào)至107個/mL，分別取雙親原生質(zhì)體各 0.5 mL以 1∶1混合，4000 r/min離心10 min，棄上層液，得原生質(zhì)體后加入電融合滲穩(wěn)劑，洗滌2次，定容至1 mL。將一定量的原生質(zhì)體混合液加入融合小室，打開融合儀電源，調(diào)節(jié)交變電壓、交變電場頻率、脈沖場強、脈沖個數(shù)和脈沖間隔到所需位置，時隔30 s先后按下成串脈沖、融合脈沖和脈沖觸發(fā)開關，30 s后將小室內(nèi)溶液吸出并用MgSO4滲穩(wěn)劑稀釋，定容至1 mL，取其稀釋液涂布于糙皮側(cè)耳固體再生培養(yǎng)基上，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)22～30 d，觀察記錄菌落生長情況并計數(shù)，計算融合率（郭成金等，2010）。

融合率/%＝2×（再生菌落數(shù)/兩親本菌落數(shù)總和）×100。

1.2.4 融合株篩選

1.2.4.1 拮抗鑒定試驗方法 參照王紅（2014）的方法，將提純復壯后的融合子分別與糙皮側(cè)耳等距離接種于綜合培養(yǎng)基上，27℃暗培養(yǎng)，觀察頡頏現(xiàn)象。

1.2.4.2 菌絲形態(tài)學比較 參照王淑珍等（2003a）的方法，將融合子接種到綜合培養(yǎng)基上，將滅菌后的蓋玻片45o插入離菌落接種點1 cm處，27℃暗培養(yǎng)，待菌絲生長到蓋玻片1/3處，取出蓋玻片，制成臨時裝片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.2.5 RAPD分子鑒定方法

1.2.5.1 基因組DNA的提取 糙皮側(cè)耳和融合子的DNA提?。簩?00 μL DNA提取液 （Tris-HCl-EDTA）、400 μL 氯化芐、200 μL SDS （10%）和 6 μL ProteinaseK（20 mg/mL）在無菌離心管內(nèi)預混。取液體培養(yǎng)6 d的菌絲體，用無菌dd H2O清洗除雜質(zhì)，并用濾紙將水分吸干，稱取0.1 g置于研缽中（-20℃預冷）。液氮研磨充分后裝于盛有預混裂解液的離心管中，急劇搖晃呈乳白色，冰浴10 min后60℃水浴50 min，每隔10 min搖勻一次。10000 r/min離心20 min，取上清，加入600 μL NaAc，放入冰水混合物中水浴50 min，8000 r/min離心15 min取上清，加等體積氯仿混勻，8000 r/min離心取上清，重復一次。加1.5倍體積無水冰乙醇混勻，放入-20℃冰箱沉淀DNA 20 min，8000 r/min離心 15 min去上清，再用80%的乙醇洗滌2次，離心，棄上清。室溫條件下自然風干后，加入適量TE使DNA完全溶解。加入 3 μL RNase（10 mg/mL），37%溫浴 60 min，分裝，保存。

酵母DNA的提取方法參考馬恒德（2012）。

1.2.5.2 PCR反應體系及程序 PCR反映體系及反應程序見表2和表3。

表2 RAPD-PCR反應體系

表3 RAPD-PCR反應程序

1.2.5.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測 按表4進行瓊脂糖電泳，電泳后于凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

表4 DNA純度和PCR產(chǎn)物檢測條件

1.2.5.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 將PCR擴增產(chǎn)物中分子量不同的DNA條帶視為多態(tài)性狀，根據(jù)電泳結(jié)果記錄清晰可重復條帶。同一引物擴增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為一個位點，擴增陽性賦值為1，陰性賦值為0，建立特征數(shù)據(jù)矩陣。使用NTSYS-pc2.1e軟件進行數(shù)據(jù)分析，求相似系數(shù)矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 電融合試驗結(jié)果分析 對表5中各因素的極差進行比較，結(jié)果表明脈沖個數(shù)的極差最大，說明其對點融合率的影響最大，影響因素依次為脈沖個數(shù)＞脈沖場強＞脈沖間隔＞交變電壓＞交變電場頻率。綜合考慮，最佳的電融合條件為交變電壓30 v，交變電場頻率1100 kHz，脈沖場強6 kv/cm，脈沖個數(shù)4個，脈沖間隔10 μs。此時，融合率達到 4.396×10-5。

2.2 融合株的篩選 在再生培養(yǎng)基上共長出42個再生菌落，篩選出3個菌落形態(tài)特征與親本糙皮側(cè)耳相近且遺傳穩(wěn)定的疑似融合株。

表5 原生質(zhì)體電融合的正交試驗結(jié)果

2.2.1 拮抗鑒定試驗 3株疑似融合株與親本間均存在明顯的拮抗現(xiàn)象，其中菌株S、T與親本對峙生長，拮抗線處有溝；G5與親本對峙生長，拮抗線處形成脊。

2.2.2 菌絲形態(tài)學比較 菌絲形態(tài)學比較結(jié)果顯示，融合株菌絲體均與糙皮側(cè)耳相似（表6）。

表6 親本與融合株菌絲形態(tài)比較結(jié)果

2.3 融合株的分子生物學鑒定

2.3.1 RAPD結(jié)果 用篩選出來的5條RAPD引物對雙親菌株及3個融合株的DNA進行擴增，擴增結(jié)果如圖1所示。

圖1 隨機引物擴增的RAPD指紋圖譜

RAPD-PCR共擴增出了164條較為清晰DNA條帶，片段大小為100～1500 bp。比較電泳圖發(fā)現(xiàn)，5種引物在所有的供試材料中均能獲得不同的DNA條帶，顯示出親本及融合株各自的特異性，同時親本與融合株及融合株間又具有相同的條帶，說明親本與融合株及融合株間的親緣關系。

2.3.2 相似系數(shù)分析 RAPD標記數(shù)據(jù)計算雙親菌株與融合株間的遺傳相似系數(shù)為0.25～0.42，說明3株再生菌株均為兩親本的融合株。融合株S、T和G5與糙皮側(cè)耳的相似系數(shù)均大于與啤酒酵母的相似系數(shù)，表明3個融合株與糙皮側(cè)耳親緣關系較近，其中G5與糙皮側(cè)耳親緣關系最近（表 7）。

表7 RAPD法分析3菌株與親本間相似系數(shù)

2.3.3 聚類分析 通過NTSYS-PC軟件構(gòu)建融合株與親本遺傳相似性聚類分析圖（圖2），可直觀地反映出親本和融合株之間的遺傳差異以及各自親緣關系的遠近。

3 討論

圖2 3個融合株與2個親本相似性系數(shù)聚類圖

3.1 電融合參數(shù) 細胞電融合是利用細胞在相對電極之間的介電電泳，誘導細胞按特定方向排列，通過電極間產(chǎn)生的較高場強的電脈沖使相互接觸的細胞發(fā)生電穿孔，進而發(fā)生電融合。融合后的細胞得到了不同細胞的遺傳物質(zhì)，具有新的遺傳或生物特性。

影響電融合的因素較多，當脈沖場強不夠大時，不能形成空洞或形成空洞的數(shù)量不夠，而不能出現(xiàn)融合；如果超過臨界擊穿電壓過多，易造成原生質(zhì)體質(zhì)膜不可逆擊穿和在原生質(zhì)體內(nèi)部引起過高的電流密度而降低其活力?？赡嫘噪姄舸┑呐R界電壓是電場誘導融合的關鍵，除受許多外界因素影響外，還由原生質(zhì)體的種類和生理狀態(tài)所決定。交變電壓較小時，原生質(zhì)體不成串，交變電壓過大時，產(chǎn)生擠壓使部分原生質(zhì)體變形破裂，從而導致細胞融合的失敗。脈沖間隔或脈沖個數(shù)過大時，原生質(zhì)體絕大多數(shù)被不可逆擊穿，原生質(zhì)體存活率迅速下降，因而融合率降低，過小則不能形成空洞（許俊艷等，2008）。

3.2 融合株鑒定 對菌株進行有效和準確鑒定是開發(fā)和利用它們的前提條件。目前融合株的鑒定多采用拮抗試驗（周曉見等，2011）和菌絲形態(tài)學比較（郭春宣等，2010）等生物學鑒定方法和同工酶電泳圖譜分析（曾榮等，1994）等生化鑒定方法，隨機擴增多態(tài)性DNA （RAPD）（李海波等，2007）、簡單序列重復區(qū)間 （ISSR）（劉志曦等，2014）、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)間（ITS）（謝放等，2011）等分子生物學鑒定方法。其中，拮抗試驗和菌絲形態(tài)比較方法可作為融合株初篩方法，生化和分子生物學鑒定可作為融合子進一步鑒定的依據(jù)。融合株與親本間的拮抗現(xiàn)象顯示了融合子與親本的不親和性，這種不親和性可用作融合株的早期快速鑒定。不同程度的拮抗現(xiàn)象說明融合菌株的遺傳和生理特性的變化是多樣的，提供了選擇優(yōu)良融合菌株的可能性（張鑒銘等，1993）。菌絲形態(tài)、鎖狀聯(lián)合和隔膜也反映了融合株基本的形態(tài)學特征。源于未融合的單核原生質(zhì)體的菌株則菌絲沒有鎖狀聯(lián)合，只有來源于融合子的雙核菌絲會發(fā)生鎖狀聯(lián)合，所以此方法可作為融合株的初步鑒定。

理論上可以通過拮抗試驗和菌絲形態(tài)比較對融合株進行鑒定，本研究中由于融合株間及與親本間生物學特征差異較小，因此同時采用RAPD分子生物學鑒定方法，增加了鑒定的準確度。RAPD通常采用多個具有10 bp左右的寡聚核苷酸作隨機引物，由于不同的引物擴增出的DNA段數(shù)和大小不同，存在大量的RAPD標記，是進行鑒定的一種快速、準確的方法。本研究從20種引物中篩選出5種擴增出DNA條帶較多的引物，通過PCR反應和凝膠電泳觀察即可得到詳細的DNA多態(tài)性。王淑珍等（2003b）試驗中發(fā)現(xiàn)融合子的譜代并不是親本譜代的簡單疊加，這可能是融合后基因重組引起引物結(jié)合位點改變的結(jié)果。

4 結(jié)論

糙皮側(cè)耳與釀酒酵母原生質(zhì)體最佳電融合條件為：交變電壓30 V，交變電場頻率1100 kHz，脈沖場強6 kV/cm，脈沖個數(shù)4個，脈沖間隔10 μs，融合率為4.396×10-5。通過拮抗試驗和菌絲形態(tài)試驗，結(jié)合RAPD分子生物學方法對再生菌株進行篩選鑒定，證明選出的3株疑似融合株（S、T、G5）均為糙皮側(cè)耳和釀酒酵母原生質(zhì)體的融合株。

[1]范寰，梁軍峰，趙潤，等.白腐真菌在木質(zhì)素微生物降解中的作用[J].天津農(nóng)業(yè)科學，2009，15（5）：19 ～ 22.

[2]郭成金，趙潤，朱文碧.冬蟲夏草與蛹蟲草原生質(zhì)體融合初探[J].食品科學，2010，1：165 ～ 171.

[3]郭春宣，王峰，董愛榮.粗毛纖孔菌形態(tài)學鑒定及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國農(nóng)學通報，2010，2（63）：142 ～ 145.

[4]李海波，吳學謙，應國華，等.緣蓋牛肝菌純培養(yǎng)菌種的RAPD和ITS分子標記鑒定[J].食用菌學報，2007，14（1）：1 ～ 5.

[5]劉志曦，李志強，魏海蓮，等.平菇ISSR遺傳多樣性分析[J].北方園藝，2014，12：94 ～ 99.

[6]馬恒德.利用原生質(zhì)體融合技術選育高效秸稈降解菌株的研究 [D].天津：天津師范大學.2012.

[7]涂苑楠，荊蓉，劉西周，等.糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J].飼料研究，2013，4：29 ～ 31.

[8]王紅.白靈菇與香菇原生質(zhì)體融合研究：[碩士學位論文][D].天津：天津師范大學，2014.

[9]王淑珍，白晨，范俊，等.靈芝與糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融合子基因組RAPD分析[J].食用菌學報，2003a，10（1）：1 ～ 5.

[10]王淑珍，范俊，揚家峰，等.靈芝與糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融合子生物學特性的初步研究[J].食用菌學報，2003b，10（2）：5 ～ 8.

[11]謝放，朱子雄，陳京津.甘肅省冬蟲夏草菌的RAPD和ITS序列分析[J].中國微生態(tài)學雜志，2011，23（3）：219 ～ 222.

[12]許俊艷，高年發(fā)，張悅，等.原生質(zhì)體電融合法構(gòu)建葡萄酒降酸酵母的研究[J].釀酒科技，2008，1：48 ～ 51.

[13]燕曉翠，涂苑楠，孟繁瑞，等.糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體與釀酒酵母原生質(zhì)體最佳融合條件的研究[J].飼料研究，2015，8：23-27.

[14]曾榮，劉祖同，張樹庭.食用菌滅活原生質(zhì)體電融合及屬間融合產(chǎn)物的鑒定分析[J].微生物學報，1994，35（2）：149 ～ 154.

[15]周曉見，靳翠麗，董夏偉，等.一株煙草青枯病生防真菌的篩選與鑒定[J].中國植保導刊，2011，31（12）：11 ～ 14.

[16]張鑒銘，鄭玉萍，陳梅英.云南野生和栽培香菇原生質(zhì)體的電融合[J].云南植物研究，1993，15（1）：67 ～ 70.