劉 穎，林 風(fēng)，鄭軍榮，陳利丁，高振云，李志強(qiáng)，王海龍，王焌翔，吳麗云

(1.福建省微生物研究所;2.福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350007)

紅曲是以大米為原料，由紅曲菌繁殖而來(lái)的一種米曲，其已廣泛應(yīng)用于食品釀造和食用色素方面[1].隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，紅曲活性次級(jí)代謝物質(zhì)的功能已成為研究熱點(diǎn).其中，莫納可林K(Monacolin K)是膽固醇合成關(guān)鍵酶HMG-CoA的還原酶抑制劑，能阻斷膽固醇的合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)人體內(nèi)的異常血脂，治療高血脂[2].天然發(fā)酵紅曲中的Monacolin K由酸式和內(nèi)酯式2種結(jié)構(gòu)組成(以酸式結(jié)構(gòu)為主)，酸式Monacolin K 無(wú)需水解即可直接發(fā)揮降血脂功能[3];僅 0.001－0.005 μg·mL－1Monacolin K 即可使膽固醇的合成受阻[4]，半致死劑量為1000 mg·kg－1(口服)，是目前各國(guó)公認(rèn)的降膽固醇的理想藥劑.

由于紅曲代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有腎毒素和潛在的致畸性的桔霉素，嚴(yán)重影響紅曲的應(yīng)用.因此，采用優(yōu)化發(fā)酵、菌種篩選等技術(shù)研發(fā)高產(chǎn)Monacolin K且低產(chǎn)甚至不產(chǎn)桔霉素的功能性紅曲成為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)革命的致高點(diǎn)[5].許贛榮等[6]通過(guò)自然篩選找到一株低桔霉素的紅曲菌，其發(fā)酵產(chǎn)物中酸式Monacolin K的比例大于60%;吳祖芳等[7]經(jīng)過(guò)復(fù)合誘變處理得到不產(chǎn)桔霉素紅曲菌變異株;Fu et al[8]從分子生物學(xué)水平上對(duì)紅曲菌進(jìn)行基因工程改造，得到了理想的桔霉素基因敲除菌株，其桔霉素含量可下降98%左右.

福建省是我國(guó)紅曲的主要傳統(tǒng)生產(chǎn)地，但目前福建省內(nèi)的紅曲產(chǎn)品以色曲為主，有關(guān)功能性紅曲產(chǎn)品的研究及開(kāi)發(fā)尚未見(jiàn)報(bào)道.因此，本試驗(yàn)對(duì)福建省古田地區(qū)不同來(lái)源的紅曲米和紅曲粉進(jìn)行分離純化，利用形態(tài)學(xué)觀察、固態(tài)發(fā)酵和HPLC檢測(cè)，篩選產(chǎn)Monacolin K且桔霉素含量低的紅曲菌株，并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，為后期的工業(yè)開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 紅曲樣品 從福建古田地區(qū)收集不同來(lái)源的紅曲米和紅曲粉.

1.1.2 試劑 內(nèi)酯式Monacolin K(即洛伐他汀)標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):100600201003)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所，含量為99.4%;甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純;其他試劑為分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基:葡萄糖 5 g，蛋白胨 1.5 g，酵母粉 1.0 g，硫酸鎂 0.05 g，磷酸二氫鉀 0.1 g，硝酸鈉 0.3 g.

固體發(fā)酵培養(yǎng)基:將50 g大米浸泡過(guò)夜，瀝干裝入500 mL三角瓶中，蒸熟后攪拌至松散再經(jīng)121℃滅菌30 min.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲的分離純化 將不同來(lái)源的紅曲米置于無(wú)菌研缽中研磨成紅曲粉末.取0.5 g紅曲粉末加入10 mL無(wú)菌水，梯度稀釋，分別吸取0.1 mL不同濃度稀釋液涂布于PDA分離平板上，30℃培養(yǎng).挑取單菌落轉(zhuǎn)接至試管斜面培養(yǎng).若菌落不純?cè)侔瓷鲜龇椒ǚ磸?fù)進(jìn)行分離純化，至出現(xiàn)純凈的紅曲霉菌落為止.

1.2.2 紅曲的篩選 根據(jù)紅曲在PDA分離培養(yǎng)基上形成單菌落顏色的深淺，初篩時(shí)挑選產(chǎn)生色素較少、顏色較淺的菌落轉(zhuǎn)接斜面，30℃培養(yǎng)7 d.復(fù)篩需將初篩挑選出的菌株分別進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間25－30 d.通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中酸式和內(nèi)酯式Monacolin K的含量，從而篩選出能合成Monacolin K的紅曲菌株.

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵 用無(wú)菌水沖洗紅曲菌斜面孢子至帶玻璃珠的三角瓶中，再用玻璃珠將孢子打散制成106cfu·mL－1孢子懸液.以2%接種量將菌懸液接入種子培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min－1振蕩培養(yǎng)48 h.將生長(zhǎng)好的種子液以10%接種量轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)溫度由30℃逐步降至24℃，變溫發(fā)酵至第26天結(jié)束.

1.2.4 分析方法 樣品處理:參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行處理.

酸式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品的制備:參照文獻(xiàn)[9]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.用少量乙腈溶解，同時(shí)用0.1 mol·L－1NaOH調(diào)節(jié)不同pH，并延長(zhǎng)超聲時(shí)間至2 h，過(guò)濾后于4℃保存，作為HPLC檢測(cè)時(shí)的定性標(biāo)準(zhǔn)品待用.

HPLC 檢測(cè)條件[10]:色譜柱為 Kromasil C-18、5 μm、250 mm×4.6 mm，柱溫 28 ℃，流動(dòng)相 V乙腈∶V0.1g·dL－1磷酸水溶液=65 ∶35，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為 238 nm.

桔霉素檢測(cè):將發(fā)酵樣品送福建省疾病預(yù)防控制中心檢測(cè).

1.2.5 菌落的形態(tài)觀察 將同一紅曲單菌落分別點(diǎn)板接種于 Wa、MEA、CYA、G25N平板培養(yǎng)基[11]上，25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)、顏色[12]、大小等.

用接種針在紅曲試管斜面上取少量孢子分別于Wa、MEA、CYA、G25N平板培養(yǎng)基[11]上劃線，將無(wú)菌蓋玻片斜插入培養(yǎng)基中，于25℃倒置培養(yǎng).分別于4、7 d后，用無(wú)菌鑷子將粘有菌絲的蓋玻片小心取下，快速經(jīng)火焰干燥，將蓋玻片固定于一塊干凈的載玻片上，并在40×10倍顯微鏡下觀察紅曲(菌絲、分生孢子、閉囊殼等)形態(tài)特征[13－14].

1.2.6 紅曲菌的分子生物學(xué)鑒定 紅曲菌總DNA的提取參照文獻(xiàn)[15].采用ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS的正向引物為ITS1:5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'，反向引物為ITS4:5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'.引物由上海生工生物工程有限公司合成.PCR擴(kuò)增ITSl-5.8SrDNA-ITS2基因區(qū)域，所得產(chǎn)物送上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序.將測(cè)序結(jié)果用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較，選取同源性較高的菌株的ITSl-5.8SrDNA-ITS2區(qū)域序列作為參比對(duì)象.用ClustalX軟件按照最大同源性原則進(jìn)行多序列比對(duì).采用MEGA軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲菌株的分離純化

對(duì)不同來(lái)源的紅曲米和紅曲粉進(jìn)行分離純化后，根據(jù)其在PDA分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的形態(tài)和顏色，共挑選出6種紅曲菌，共計(jì)96株.

在PDA分離培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)48 h，平板上出現(xiàn)白色單菌落;72 h單菌落增大的同時(shí)開(kāi)始變色，呈現(xiàn)不同顏色;4 d后部分單菌落顏色繼續(xù)加深，部分菌落背面出現(xiàn)放射狀皺褶;繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后，不同菌落形態(tài)分化較明顯，主要形態(tài)特征如表1所示(顏色描述參照文獻(xiàn)[12]).

表1 紅曲菌的形態(tài)分類Table 1 Different morphologies of Monascus

2.2 Monacolin K 的檢測(cè)

2.2.1 酸式Monacolin K的制備 在一定的堿性條件下，內(nèi)酯式Monacolin K可水解成為酸式Monacolin K.但若堿性太強(qiáng)，酸式 Monacolin K 可進(jìn)一步水解[16].按照文獻(xiàn)[9]制備酸式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品，溶液pH＞13，內(nèi)酯式Monacolin K水解生成其他雜質(zhì)，酸式Monacolin K轉(zhuǎn)化率降低.同時(shí)，由于內(nèi)酯式Monacolin K不溶于水，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后的水溶液中仍有部分不溶的針狀固體.經(jīng)HPLC檢測(cè)，不溶針狀固體為內(nèi)酯式Monacolin K，制備液中酸式Monacolin K含量低，且有不明雜質(zhì)峰出現(xiàn)于3.5 min(圖1).

本試驗(yàn)在配制內(nèi)酯式Monacolin K時(shí)添加了少量乙腈助溶，減少了堿濃度，降低了溶液pH;同時(shí)提高超聲轉(zhuǎn)化的時(shí)間，有利于內(nèi)酯式Monacolin K充分水解為酸式Monacolin K.在相同處理?xiàng)l件，隨著溶液pH的增大，Monacolin K的生成率也相應(yīng)升高.當(dāng)溶液pH為10左右，Monacolin K轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高(圖2).經(jīng)HPLC-MS鑒定，生成物質(zhì)的分子質(zhì)量與酸式Monacolin K分子質(zhì)量一致(圖3).此外，經(jīng)HPLC檢測(cè)，酸式和內(nèi)酯式Monacolin K能夠很好地分離，保留時(shí)間分別為9.5和 15.46 min(圖 4).

圖1 pH＞13時(shí)溶液中的不明雜質(zhì)峰Fig.1 The unknown impurity peak in the solution at pH＞13

圖2 不同pH下酸式Monacolin K的生成率Fig.2 The formation rate of acid form Monacolin K at different pH

圖3 酸式Monacolin K的MS檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The result of MS detection for acid form Monacolin K

2.2.2 復(fù)篩菌株Monacolin K的含量 通過(guò)對(duì)復(fù)篩的紅曲菌種進(jìn)行大米固體發(fā)酵，HPLC檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，得到一株產(chǎn)Monacolin K的紅曲菌株NW3-2.經(jīng)檢測(cè)，該菌株發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素含量低于最低檢測(cè)限16.0 μg·kg－1(圖5－6)，發(fā)酵合成的總Monacolin K含量為5.67 mg·g－1，其中，酸式和內(nèi)酯式 Monacolin K 含量分別為3.20和 2.47 mg·g－1(圖 7).

圖4 酸式和內(nèi)酯式Monacolin K的HPLC圖譜Fig.4 The HPLC result of acid form and lactone form Monacolin K

圖5 NW3-2發(fā)酵樣品中桔霉素檢測(cè)的HPLC圖譜Fig.5 The HPLC result of citrinin in the fermentation products of NW3-2

2.3 紅曲菌落的形態(tài)特征

表2為復(fù)篩挑選出的紅曲菌NW3-2在Wa、MEA、CYA、G25N培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d形成的菌落特征.參考中國(guó)科學(xué)院微生物研究所保存的11種紅曲典型種的綜合描述[11]，結(jié)合其在G25N培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，初步排除紅曲菌株NW3-2是紅色紅曲、橙色紅曲、發(fā)白紅曲、蒼白紅曲和血紅紅曲的可能.

2.4 紅曲菌在不同培養(yǎng)基上的顯微形態(tài)特征

紅曲的個(gè)體形態(tài)包括菌絲、無(wú)性世代和有性世代.由表3可知，在Wa、MEA培養(yǎng)基上的菌絲顯微形態(tài)較相似，以有性繁殖形成閉囊殼為主，分生孢子偶見(jiàn);在CYA、G25N培養(yǎng)基上以無(wú)性繁殖形成分生孢子為主.

圖6 桔霉素添加到發(fā)酵樣品中的HPLC圖譜Fig.6 The HPLC result of citrinin added to the fermentation sample

圖7 NW3-2紅曲發(fā)酵產(chǎn)物HPLC圖譜Fig.7 The HPLC result of the fermentation products of Monascus NW3-2

表2 紅曲菌NW3-2在25℃培養(yǎng)7 d的菌落特征Table 2 The colony characteristics of Monascus NW3-2 cultured for 7 days at 25℃

表3 紅曲菌NW3-2在不同培養(yǎng)基上的顯微形態(tài)特征Table 3 The microstructure of Monascus NW3-2 growing on the different culture media

2.5 分子生物學(xué)鑒定

2.5.1 紅曲菌NW3-2的ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增結(jié)果 通過(guò)PCR擴(kuò)增紅曲菌 NW3-2的 ITSl-5.8SrDNA-ITS2區(qū)域基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到約600 bp的特異性條帶(圖8).

2.5.2 紅曲菌 NW3-2 ITSl-5.8SrDNA-ITS2 基因區(qū)域測(cè)序結(jié)果 多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，紅曲菌NW3-2與紫色紅曲M.purpureus ATCC16365(AF451857)、橙色紅曲 M.aurantiacus AS 3.4384(DQ978995)、叢 毛 紅 曲 M.pilosusFRR2194(GU733334)、發(fā) 白 紅 曲 M.albidulusAS3.568(DQ978994)、紅色紅曲 M.ruber BCRC 31532(JX173297)的ITS堿基序列[17]最為接近.其中與叢毛紅曲、發(fā)白紅曲、紅色紅曲的序列相似達(dá)99%，僅相差1個(gè)堿基.圖9表明，本試驗(yàn)篩選出的紅曲菌NW3-2與叢毛紅曲、發(fā)白紅曲、紅色紅曲相差1個(gè)堿基序列，紫色紅曲和橙色紅曲與紅曲菌NW3-2相差2個(gè)堿基序列.

圖8 紅曲菌NW3-2的ITS區(qū)域PCR電泳圖Fig.8 Electropherogram of ITS regions of Monascus NW3-2

圖9 基于ITSl-5.8SrDNA-ITS2區(qū)域序列構(gòu)建的發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.9 The phylogenetic tree based on 5.8S rDNA domain sequence alignment

3 小結(jié)與討論

Monacolin K是紅曲胞內(nèi)產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)的積累速率基本與生長(zhǎng)同步，適于固態(tài)發(fā)酵法，且我國(guó)的紅曲霉固態(tài)發(fā)酵技術(shù)較為成熟，在篩選中運(yùn)用該方法能更準(zhǔn)確地挑選出具有合成Monacolin K能力的紅曲菌株.

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同紅曲產(chǎn)品的菌種進(jìn)行分離純化，得到不同形態(tài)和顏色的紅曲菌株96株，通過(guò)挑選顏色較淺的紅曲菌株，并經(jīng)固態(tài)發(fā)酵檢測(cè)其代謝產(chǎn)物Monacolin K和桔霉素含量，篩選出一株具工業(yè)化生產(chǎn)前景的功能紅曲菌株NW3-2.該紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素含量低于最低檢測(cè)限16.0 μg·kg－1(符合歐標(biāo)和日本標(biāo)準(zhǔn)).經(jīng)多次固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)證實(shí)，功能紅曲菌株NW3-2發(fā)酵產(chǎn)物均符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9].此外，酸式Monacolin K含量指標(biāo)是最終產(chǎn)品品質(zhì)控制的關(guān)鍵參數(shù)之一，本研究還優(yōu)化了酸式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品的制備條件.

經(jīng)ITS區(qū)域序列分析表明，紅曲菌NW3-2與叢毛紅曲、發(fā)白紅曲、紅色紅曲的序列相似性達(dá)99%;但使用單一的分析方法仍難以最終確定其種類.目前，國(guó)際上對(duì)于紅曲菌屬以下種的分類仍未能形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[18－19].對(duì)于同一菌株而言，基因測(cè)序會(huì)受到所選用DNA片段和引物的影響而產(chǎn)生不同的結(jié)果，同時(shí)個(gè)體間差異也影響分類判斷.如郭芳等[20]曾對(duì)4種紅曲菌株的ITS區(qū)域基因進(jìn)行測(cè)序，該4種紅曲菌株在形態(tài)上有顯著差異，但其ITS基因序列兩兩相同，且兩組不同的序列僅存在2個(gè)堿基的差別.因此，后期將使用多種分子標(biāo)記方法進(jìn)行綜合分析，并結(jié)合生理生化試驗(yàn)對(duì)紅曲菌NW3-2的屬種進(jìn)行更系統(tǒng)的分類鑒定.

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