劉媛，李博，陳書強，王東，孫惠君，董杰，周晶，郭雯娓，王曉紅

（第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710038）

復發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）指連續(xù)發(fā)生3次或者以上自然流產(chǎn)［1］。其發(fā)病率占到不孕不育人群的10%～15%［2-3］，引起RSA 的病因各異，如染色體異常、內(nèi)分泌異常、免疫因素感染因素和解剖因素等，但約有50%RSA 原因不明［4］，因此治療效果欠佳，嚴重影響了廣大婦女的生殖健康。微小RNA 分子（microRNA，miRNA）是廣泛分布于動植物細胞體內(nèi)，是一類內(nèi)源性非編碼的小分子RNA。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人絨毛組織中miR-133a的高表達與RSA 的發(fā)生顯著相關(guān)［5］，但具體的調(diào)控機制仍有待進一步證實。本文擬研究miR-133a對HTR8-SVneo細胞黏附和侵襲能力的影響，為臨床干預提供理論依據(jù)和新的靶點。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞系：人類滋養(yǎng)層細胞系HTR8-SVneo由本實驗室保存。

2.主要試劑及儀器：miR-133a的mimics、inhibitor、無義序列（上海吉瑪），脂質(zhì)體Lipfectamine 3000（Invitrogen，美國），DMEM／F12（1：1）培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），Matrigel膠（BD，美國），光學顯微鏡、酶標儀、熒光定量PCR分析儀（伯樂，美國）。

二、研究方法

1.細胞培養(yǎng)：HTR8-SVneo 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM／F12（1：1）培養(yǎng)基中，細胞置于5%CO2、95%濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.細胞轉(zhuǎn)染及分組：按照Lipfectamine 3000說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1d接種適量HTR8-SVneo細胞于6孔板中，細胞融合度達到50%～70%時轉(zhuǎn)染miR-133a的mimics、inhibitor、無義序列。以無義序列為空白對照。miR-133a的mimics序列為 5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’，miR-133a 的 inhibitor 序 列 為 5 ’-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3’，無義序列 為：5’-U UGUACUACACAAAAGUACUG-3’。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組HTR8-SVneo細胞進行以下實驗。

3.實時熒光RT-PCR 技術(shù)檢測各組HTR8-SVneo中miR-133a的表達：轉(zhuǎn)染后48h 后，采用miRNA 提取試劑盒（lifetechnologes，美國）提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度儀測定RNA 濃度后，按照RT 試劑（上海吉瑪）說明書合成cDNA。miR-133a的引物序列，以U6 為內(nèi)參，引物序列見表1。引物由上海吉瑪公司合成。參照實時熒光RT-PCR 試劑盒（上海吉瑪）說明書配制實時定量PCR 反應體系，每個體系為20μl。PCR 反應條件如下：95 ℃，3min；95 ℃12s，60 ℃40s，40個循環(huán)。具體操作按說明書進行。以2△△t方法計算目的基因的表達水平，實驗重復3次。

表1 PCR 實驗引物序列

4.MTT 法檢測細胞黏附能力：鋪每孔2μg層粘連蛋白（LN）于96 孔板中，室溫干燥后，用2%BSA 的磷酸鹽緩沖液（PBS）20μl 37 ℃封閉1h，PBS洗3 次，每孔加入5×104個轉(zhuǎn)染后48h 的HTR8-SVneo細胞，5%CO2、95%濕 度、37 ℃培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h后，PBS輕輕洗2次，洗去未黏附細胞，棄去殘余PBS，每孔加入20μl MTT（5mg／ml），于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO）溶液，震蕩混勻后，于酶標儀上測定550nm 處OD 值，實驗重復5次。按下式計算藥物對細胞的抑制率（IR）：

IR（%）＝（1—實驗組平均OD 值／對照組平均OD 值）×100%。黏附率＝（1-抑制率）×100%。

5.Transwell法測細胞侵襲能力：Transwell小室的上下室之間以孔徑為8μm 的聚碳酸酯膜孔分隔開，濾膜上層鋪蓋人工基底膠（Matrigel，BD，美國）。室溫過夜干燥。在小室中加入100 μl 的DMEM 培養(yǎng)液，置于孵箱中孵育2h，使Matrigel水化。用0.25% 胰蛋白酶消化預先轉(zhuǎn)染48h 的HTR8-SVneo細胞，800r／min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，最后用2% DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞數(shù)為5×105個／ml。吸出小室內(nèi)的培養(yǎng)基，洗去500μl含10%血清的DMEM于下室中作為趨化因子，加100μl細胞懸液于內(nèi)室中，5%CO2、95% 濕度、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，吸除培養(yǎng)基，用棉簽擦拭凈Transwell小室濾膜上層的Matrigel及未穿過濾膜的細胞。將小室侵入4% 的多聚甲醛中固定10min，風干后于蘇木素染色液中染色20 min，采用蒸餾水沖洗，實驗中每組每次同時做3個重復小室，顯微鏡下觀察計數(shù)，取平均值。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染后各組miR-133a表達

運用實時熒光定量PCR 檢測各組轉(zhuǎn)染后miR-133a的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染mimics的上調(diào)組miR-133a的表達明顯高于對照組（NC），轉(zhuǎn)染inhibitor的下調(diào)組miR-133a的表達明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組miR-133a的表達

二、MTT 法檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞黏附能力的變化

轉(zhuǎn)染mimics的上調(diào)組細胞黏附能力較對照組顯著降低（P＜0.05），轉(zhuǎn)染inhibitor的下調(diào)組細胞的黏附能力較對照組顯著升高（P＜0.05）（表2）。

表2 miR-133a對滋養(yǎng)細胞黏附能力的影響［（

三、Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞侵襲力的變化

通過比較各組細胞穿過人基質(zhì)膠細胞數(shù)量的多少，評估各組細胞的侵襲能力，每組取5個高倍鏡視野。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染mimics的上調(diào)組細胞侵襲能力較對照組顯著降低（P＜0.01），轉(zhuǎn)染inhibitor的下調(diào)組細胞的侵襲能力較對照組顯著升高（P＜0.01）（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組細胞侵襲能力的變化。A、B、C分別為NC、inhibitor、mimics各組光學顯微鏡下觀察圖像 蘇木素染色 ×200；D：各組細胞侵襲能力統(tǒng)計學直方圖。

討 論

妊娠過程中，胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細胞在囊胚著床后便開始分化遷移，向子宮脫膜層和基層血管侵襲，啟動螺旋動脈的重塑過程［6］，這一過程是建立母胎循環(huán)的關(guān)鍵。絨毛外滋養(yǎng)層細胞具有的侵襲功能是保證子宮螺旋動脈重塑和妊娠順利完成的重要基礎(chǔ)。滋養(yǎng)層是獨特的上皮細胞，滋養(yǎng)層細胞的侵潤能力與其粘附能力是緊密關(guān)聯(lián)［7］。miRNAs作為生物體重要的基因調(diào)控分子，在不同生理、病理期以及不同的組織細胞類型中，miRNAs的表達豐度不同［8］。miRNAs的異常表達可能與多種疾病的發(fā)生相關(guān)［9-14］。

前期研究提示：miR-133a在RSA 患者流產(chǎn)絨毛中表達量顯著上調(diào)。但是其具體的表達調(diào)控機制尚不清楚。本研究首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染降調(diào)或者上調(diào)滋養(yǎng)層細胞系中miR-133a的表達，并通過實時熒光定量PCR 檢測其轉(zhuǎn)染結(jié)果，采用MTT 法研究miR-133a對滋養(yǎng)層細胞粘附，同時利用Transwell方法檢測miR-133a對滋養(yǎng)層細胞侵襲的影響，結(jié)果顯示下調(diào)miR-133a的表達，能增強HTR8-SVneo細胞的黏附能力，以及侵襲能力。而上調(diào)miR-133a的表達，細胞的黏附能力和侵襲能力均降低。體外實驗與前期的研究結(jié)果分析，說明復發(fā)性自然流產(chǎn)患者可能存在某種機制致使滋養(yǎng)層細胞中miR-133a表達量上調(diào)，導致細胞粘附及侵襲功能降低，而導致流產(chǎn)。

綜上所述，miR-133a在調(diào)控滋養(yǎng)層細胞粘附和侵襲方面發(fā)揮重要作用，很可能成為復發(fā)性自然流產(chǎn)侵襲的新的調(diào)節(jié)基因，為復發(fā)性自然流產(chǎn)臨床基因治療提供新的靶點。

［1］ Pandey MK，Rani R，Aqrawal S.An update in recurrent spontaneous abortion［J］.Arch Gynecol Obstet，2005，272：95-108.

［2］ Fertility and Employment.Danish Data Archives［M］.Denmark：Odense University，1979.

［3］ Zaima A，Ash A.Fibroid in pregnancy：characteristics，complications，and management［J］.Postgrad Med J，2011，87：819-828.

［4］ Emmer PM，Nelen WL，Steegers EA，et al.Peripheral natural killer cytotoxicity and CD56（pos）CD16（pos）cells increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion［J］.Hum Reprod，2000，15：1163-1169.

［5］ Wang X，Li B，Wang J，et al.Evidence that miR-133acauses recurrent spontaneous abortion by reducing HLA-G expression［J／OL］ .Reprod Biomed Online，2012，25：415-424.

［6］ Reus AD，El-Harbachi H，Rousian M，et a1.Early firsttrimester trophoblast volume in pregnancies that result in live birth or miscarriage［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2013，42：577-584.

［7］ Nadeem L，Munir S，F(xiàn)u G，et a1.Nodal signals through activin receptor-like kinase7to inhibit trophoblast migration and invasion：implication in the pathogenesis of preeclampsia［J］.Am J Pathol，2011，178：1177-1189.

［8］ Bandres E，Agirre X，Ramirez N，et al.MicroRNAs as cancer players：potential clinical and biological effects［J］.DNA Cell Biol，2007，26：273-282.

［9］ 楊燁，朱曉明，苗霞，等.Mir-18b對滋養(yǎng)細胞HTR-8細胞功能的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2013，13：2221-2224.

［10］ 李立平，吳煒景，趙亞剛.microRNA 與胃癌的研究進展［J］.中國腫瘤防治雜志，2013，20：316-320.

［11］ Chung AC，Lan HY.MicroRNAs in renal fibrosis［J］.Front Physiol，2015，6：50.doi：10.3389／fphys.2015.00050.eCollection 2015.

［13］ 萬淑瓊，張軍.miRNA 在HPV 陽性和陰性宮頸癌組織之間的差異研究［J］.海南醫(yī)學院學報，2013，19：101-103.

［14］ 馮瓊，雷章，盧宏達.miRNA 與腫瘤關(guān)系的研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6：4390-4393.