王敬華，祁建青，尤莉芳，吳宏宇，盧艷陽，任瓊珍

（江蘇蘇州市第七人民醫(yī)院，蘇州 215151）

子宮內(nèi)膜異位癥是導(dǎo)致婦女痛經(jīng)、不孕甚至癌癥的一大原因。研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者在月經(jīng)早中期內(nèi)膜組織處于缺血或者低灌注狀態(tài)［1］，而短暫的缺血缺氧促進血管新生，抑制細胞凋亡，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的異常增生。課題組前期研究顯示，缺血缺氧模型組織中血管內(nèi)皮生長因子的表達增強［2］。由于倫理學(xué)原因，目前對子宮內(nèi)膜異位癥的研究尤其是機制的研究采用的是子宮內(nèi)膜異位癥動物模型，該模型種類較多，但是較為符合“經(jīng)血逆流內(nèi)膜種植”學(xué)說［3］的是“腹腔注射內(nèi)膜法”，但是目前對于“腹腔注射內(nèi)膜法”形成的子宮內(nèi)膜缺血模型在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用及其可能分子機制，尚未定論。

材料與方法

一、主要儀器及試劑

儀器：BCM-1000超凈工作臺（廣州雷得生物）；溶氧微電極（Unisense，丹麥）；DM750 病理顯微鏡（LEICA，上海）；DY89-1 型電動玻璃超速勻漿器（寧波新芝生物）；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽、電泳儀（BIO-RAD，美 國）；ABI7700 Real-time PCR 儀（ABI，美國）。

主要試劑：卡前列素氨丁三醇注射液（欣母沛，輝瑞制藥，美國，批準(zhǔn)文號H20080251）；TUNEL 試劑盒（羅氏，美國，批號ZK-8006）；PI3K 抑制劑LY294002（Sigma，美國，批號934987-87-2）；Akt以及p-Akt（Ser473）單克隆抗體（Santa Cruz，美國，批號sc-8312、sc-9318）；Bcl-2 以 及Bax 單 克 隆 抗 體（Cell Signaling，美國）、Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）、RNA 酶抑制劑（Promega，美國）

二、試驗方法

1實驗動物：選擇SPF 級，8～10 周齡雌性C57BL／6小鼠（蘇州愛爾麥特科技），體重為20～23g，性周期在3～5周左右。飼養(yǎng)條件：根據(jù)性周期一致的原則，將5只老鼠合并為1籠，室溫為19～25 ℃，光照明暗時間為12／12h，每隔1～2d換一次墊料，及時補充水分及飼料。

2 實驗動物造模：根據(jù)參考文獻［3］以及課題組前期研究，選擇經(jīng)陰道涂片檢測處于動情期小鼠作為供體鼠，肌肉注射0.5 mg／kg欣母沛（缺血預(yù)處理，IPC）或者生理鹽水0.1ml，qd×3d；注射第4天后采用5%水合氯醛以0.001ml／g進行腹腔麻醉，麻醉后，結(jié)扎雙側(cè)子宮動脈宮端支及卵巢端（缺血處理，ISCH）或不作任何處理，2h后處死供體小鼠，收集內(nèi)膜切成1mm×1mm 大??；同時選擇經(jīng)陰道涂片檢測處于動情期雌性小鼠作為受體小鼠，將供體小鼠子宮內(nèi)膜注射到受體鼠腹腔內(nèi)，每只小鼠體內(nèi)注射8片內(nèi)膜。觀察移植內(nèi)膜存活情況及存活率。

3.實驗分組：根據(jù)供體小鼠處理方式，對應(yīng)受體小鼠分為5 組：對照組（CON 組）、預(yù)缺血處理（IPC）組、缺血處理（ISCH）組、ISCH＋IPC 組以及Akt抑制劑（LY294002）預(yù)處理的ISCH＋IPC 組（ISCH＋IPC＋LY 組）。

46只供體雌性小鼠，隨機分為5 組（10×4＋6）。5組供體小鼠預(yù)處理完畢，第4天采集各組內(nèi)膜組織注射到受體小鼠腹腔內(nèi)，每只注射8片，每組25只受體小鼠。（1）ISCH 組：小鼠不做預(yù)缺血處理，第4天做缺血處理（開腹結(jié)扎雙側(cè)子宮動脈宮端支及卵巢端2h）；（2）IPC組：小鼠做預(yù)缺血處理，第4天打開腹腔后不作缺血處理；（3）ISCH＋IPC 組：小鼠做預(yù)缺血處理后，第4天開腹做缺血處理；（4）CON 組：小鼠不做預(yù)缺血處理，第4天打開腹腔后不作缺血處理；（5）IPC＋ISCH＋LY 組：小鼠注射欣 母 沛 前15 min 給 予Akt 抑 制 劑（LY294002）10μmol／kg靜脈注射，其余按照ISCH＋IPC 組進行處理。

4.受體小鼠腹腔移植內(nèi)膜觀察及測定：造模前，各處理組留取部分供體小鼠內(nèi)膜組織為造模前對照組織。造模后第7天，采用頸椎脫臼處死受體小鼠，觀察并測量受體小鼠腹腔移植內(nèi)膜大小，結(jié)合組織學(xué)評分判斷病灶是否存活（根據(jù)改良的Ishak組織學(xué)評分），計算存活率。

5.組織HE染色：受體小鼠腹腔移植內(nèi)膜組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24h后，行常規(guī)石蠟切片，切片組織經(jīng)二甲苯脫蠟以及不同濃度乙醇脫水后，采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

6.TUNEL測定細胞凋亡情況：分別取造模前內(nèi)膜組織和受體小鼠造模第7天后腹腔移植內(nèi)膜，采用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況，嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行操作（每組10只）。將所得標(biāo)本切片在400倍光鏡下隨機選取5個視野，其中正常細胞呈藍色、凋亡細胞為棕黃色，計算細胞凋亡指數(shù)，即凋亡指數(shù)（AI）＝凋亡細胞數(shù)／總細胞數(shù)×100%。

7.RT-PCR 檢測Akt、Bcl-2以及Bax表達：采用Trizol法提取造模前內(nèi)膜及受體小鼠移植內(nèi)膜組織總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄，PCR 擴增Akt、Bcl-2以及Bax基因，且擴增β-actin作為內(nèi)參。配置逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng) 體 系：無RNA 酶 雙 蒸 水14.75 μl，0.5μl RNase抑制劑，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶。將100ng總RNA、2μl RT 引物以及5μl Buffer加入到上述反應(yīng)體系中，43 ℃50min、95 ℃5min進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上游及下游引物各1μl、12.5μl 2×Master Mix，補 充 雙 蒸 水 至25μl。95 ℃預(yù) 變 性5min，95 ℃變性25s、50 ℃退火30s、70 ℃延伸40s，35個循環(huán)，72 ℃后延伸5min。RT 引物以及PCR 引物見表1。記錄各個反應(yīng)管中的熒光信號所設(shè)立的閾值時循環(huán)數(shù)（CT 值），將原始數(shù)據(jù)取3 次以上重復(fù)掃描后取平均值。

表1 一氧化氮合酶基因異構(gòu)體以及β-actin引物序列

8.Western Blot檢測Akt、p-Akt以及Bcl-2、Bax表達：取各受體小鼠移植內(nèi)膜組織100 mg，直接加入200μl細胞裂解液及15μl PMSF 進行勻漿，將勻漿后的液體置于冰上裂解30min，4 ℃下以12 000r／min離心30min，去上清，經(jīng)考馬斯亮藍法定量。蛋白質(zhì)樣品同1／4倍量5×SDS上樣緩沖液混合均勻，熱水煮沸7～8min，在10%SDS-PAGE 115V 進行電泳，200mA 恒流2h，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，再以5%脫脂奶粉TBST 緩沖液室溫封閉3h，加 一 抗（即 鼠 抗 人p-Akt、Akt 以 及Bcl-2、Bax）。TBST 洗膜3次，每次10min，然后與結(jié)合有辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 室溫孵育1h，TBS洗膜3 次，每次10 min，與化學(xué)發(fā)光劑ECL反應(yīng)，X 線膠片曝光顯影。組織中p-Akt、Akt以及Bcl-2、Bax蛋白含量的測定采用的是灰度值掃描，通過與β-actin進行比較得出灰度值比。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

分別采用SPSS17.0及ImageJ 4.2對數(shù)據(jù)及圖片進行分析處理。正態(tài)計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗；對于計數(shù)資料采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組移植內(nèi)膜形態(tài)學(xué)觀察

造模后第7天肉眼觀察，所有組別均可見病灶。通過鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，有明顯的血管形成（圖1）。

IPC組成模率高于其他各組（P＜0.05）；IPC＋ISCH 組成模率以及內(nèi)膜存活率均高于ISCH 組（P＜0.05）（表2）。

圖1 各組移植內(nèi)膜形態(tài)學(xué)觀察

表2 各組造模成功率及內(nèi)膜存活率

二、各組移植內(nèi)膜組織細胞凋亡情況

ISCH 組以及IPC＋ISCH 組細胞出現(xiàn)萎縮、變圓，細胞邊緣破裂，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)沉積，而CON 組、IPC組細胞完整性較好（圖2）。

造模后ISCH 組以及IPC＋ISCH 組凋亡細胞數(shù)量明顯增加。其中，CON 組細胞凋亡指數(shù)（AI）為（16.21±2.91）%，略 高 于IPC 組 的（14.89±3.75）%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.979）；IPC＋ISCH 組AI為（57.64±7.62）%，低于ISCH 組的（83.45±8.11）%，而高于IPC 組，均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。此外，ISCH 組AI高于IPC 組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）（圖3）。

圖2 各組移植內(nèi)膜細胞凋亡情況 TUNEL染色 ×400

三、RT-PCR 檢測受體小鼠移植內(nèi)膜組織中Akt-mRNA、Bcl-2-mRNA 以 及Bax-mRNA 表 達

通 過RT-PCR 檢 測 發(fā) 現(xiàn)，IPC 組、ISCH 組 以 及IPC＋ISCH 組中Akt-mRNA、Bcl-2-mRNA 以及Bax-mRNA 表達均呈不同程度升高，其中IPC 組Akt、Bcl-2以及Bax等mRNA 均高于CON 組且具有 統(tǒng) 計 學(xué) 差 異（P ＜0.05）；ISCH 組 以 及IPC＋ISCH 組Akt-mRNA、Bcl-2-mRNA 低于IPC 組，而Bax高于IPC 組（P＜0.05）；IPC＋ISCH＋LY 組Akt-mRNA、Bcl-2-mRNA 低 于IPC 組 及IPC＋ISCH 組，而Bax高于IPC組但低于IPC＋ISCH 組（P＜0.05）；IPC＋ISCH 組與ISCH 組之間三種mRNA 表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖4）。

圖3 TUNEL檢測各組移植內(nèi)膜細胞凋亡指數(shù)（%）

圖4 不同組別移植內(nèi)膜組織Akt-mRNA、Bcl-2-mRNA 以 及Bax-mRNA 表 達

四、Western blot檢測移植內(nèi)膜組織中p-Akt、Akt、Bcl-2以及Bax表達

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，IPC 組p-Akt、Bcl-2及Bax蛋白表達量均高于CON 組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；ISCH 組p-Akt、Bcl-2蛋白表達量低于IPC組（P＜0.05）；IPC＋ISCH 組p-Akt、Bcl-2 蛋白表達量高于ISCH 組、而Bax 蛋白表達量低于ISCH 組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；IPC＋ISCH＋LY 組p-Akt、Bcl-2蛋白表達量低于IPC＋ISCH組（P＜0.05），而Bax蛋白表達量高于IPC＋ISCH組（P＜0.05）（圖5）。

討 論

目前對于子宮內(nèi)膜異位癥存在多種學(xué)說，其中以Sampson［3］提出的“經(jīng)血逆流內(nèi)膜種植學(xué)說”能更好地解釋這一臨床現(xiàn)象，但是該學(xué)說卻不能解釋“為何90%以上婦女出現(xiàn)經(jīng)血逆流，卻只有15%的女性出現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥”這一現(xiàn)象［1］。

近年來，有學(xué)者認為子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜腺體類似于惡性腫瘤細胞，能夠產(chǎn)生“粘附、侵襲、血管新生以及抗凋亡”的作用［4］。目前對于“凋亡抵抗”是形成子宮內(nèi)膜異位癥病灶的研究已成為熱點。子宮內(nèi)膜細胞凋亡受卵巢甾體激素調(diào)節(jié)，增生期雌激素促進內(nèi)膜細胞增生、抑制細胞凋亡，而分泌期孕激素抑制內(nèi)膜細胞增生，促進細胞凋亡［5］。子宮內(nèi)膜異位癥受到多種凋亡和抗凋亡蛋白的影響，如TNF-α、IL-8、p53等，此外多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中，Akt信號通路是其中之一［6-8］。研究證實，PI3K／Akt信號通路與血管新生密切相關(guān)，也有研究顯示該通路與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展有著一定的關(guān)系，PI3K 蛋白在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶協(xié)同作用下，可與Akt結(jié)合，促進其Ser73 位點或者Thr308位點出現(xiàn)磷酸化，從而激活該通路以及下游的靶向因子或蛋白的表達［9-10］。因此，本實驗選擇了PI3K／Akt信號通路作為研究對象。

課題組前期研究顯示，正常預(yù)缺血處理（IPC）可以促進血管內(nèi)皮生長因子的表達［2］。本研究顯示缺血預(yù)處理能夠增強組織對于隨后出現(xiàn)的嚴重缺血缺氧的耐受能力，可能是缺血預(yù)處理后刺激血管新生通路，從而達到了抑制細胞凋亡的結(jié)果。本研究顯示，采用“腹腔注射內(nèi)膜法”模型成功率尚可，但是缺血處理組（即ISCH 組）造模成功率偏低，其可能原因是實驗中結(jié)扎子宮動脈宮端支以及卵巢端時，由于缺血導(dǎo)致血供不足，使得供體小鼠體內(nèi)內(nèi)膜出現(xiàn)壞死，因此在注射到受體小鼠體內(nèi)時很難存活。

圖5 Western blot檢測移植內(nèi)膜組織中p-Akt、Akt、Bcl-2以及Bax表達

LY294002是PI3K 特異性抑制劑，能夠阻斷磷脂酰肌醇-3 磷酸（PIP3）生成，進而阻斷Akt磷酸化，影響其下游靶向因子或者蛋白的表達。本研究顯示，短暫缺血預(yù)處理（即IPC）的小鼠異位內(nèi)膜組織p-Akt表達以及Akt mRNA 表達明顯高于其他組別，而缺血處理組（ISCH）出現(xiàn)p-Akt表達以及Akt mRNA 表 達 下 降，低 于IPC 組 以 及ISCH＋IPC組，說明IPC處理可能具有促進血管新生、抑制細胞凋亡的作用，這也從TUNEL 的測定結(jié)果得到證實。LY＋IPC＋ISCH 組異位內(nèi)膜Akt基因以及p-Akt蛋白表達均低于IPC組以及ISCH＋IPC組，說明LY29004抑制PI3K 以及Akt蛋白磷酸化，從而抑制血管新生通路，這一結(jié)果也支持IPC 處理效果可能是通過PI3K／Akt通路完成。

子宮內(nèi)膜異位癥婦女在月經(jīng)前期或者早中期出現(xiàn)子宮收縮，而子宮收縮將會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜出現(xiàn)短暫缺血或者處于低灌注狀態(tài)［11］，導(dǎo)致局部組織出現(xiàn)短暫缺血、缺氧，而短暫的缺血、缺氧狀態(tài)導(dǎo)致機體血管新生，抑制細胞凋亡。正常婦女機體內(nèi)出現(xiàn)細胞凋亡其目的是排除衰老或者損傷的細胞，保證機體正常的形成代謝，正常子宮內(nèi)膜細胞凋亡出現(xiàn)周期性變化，而子宮內(nèi)膜異位癥患者由于短暫的缺血、缺氧導(dǎo)致細胞繼續(xù)存活，從而引起子宮內(nèi)膜增厚，進一步引起病變［12］。細胞凋亡由相關(guān)凋亡基因控制，而Bcl-2、Bax是在線粒體膜上具有調(diào)節(jié)作用的細胞凋亡重要分子，線粒體在細胞凋亡起著重要角色，外界刺激能夠引起線粒體的通透性的改變，引起細胞色素C 等小分子的釋放，Bcl-2出現(xiàn)下調(diào)而Bax 上調(diào)導(dǎo)致細胞凋亡［13-14］。有研究顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者Bcl-2表達明顯高于正常婦女，而Bax與正常婦女相比較無顯著性差異［15］；另有研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位、異位內(nèi)膜以及腹腔液巨噬細胞中Bcl-2的表達均明顯高于非子宮內(nèi)膜異位癥患者，而Bax卻低于非子宮內(nèi)膜異位癥患者［16］。

PI3K／Akt信號通路與促進細胞生存、抑制細胞凋亡有關(guān)，其下游信號分子有Bcl-2、Bax等。研究表明，Bcl-2／Bax 比例增高將抑制細胞凋亡，而Bcl-2／Bax比例下降將出現(xiàn)細胞凋亡［17］。本研究顯示，IPC 處理組異位內(nèi)膜Akt、Bcl-2基因及蛋白表達均高于ISCH 組，而Bax基因表達低于ISCH 組；同時，ISCH＋IPC 組Bcl-2 基因及蛋白表達高于ISCH 組、Bax基因及蛋白表達低于ISCH 組。說明IPC處理影響到了Bcl-2以及Bax基因及蛋白的表達。此外，LY＋IPC＋ISCH 組Bcl-2基因及蛋白表達低于ISCH＋IPC 組，而Bax 基因及蛋白表達高于ISCH＋IPC組。這些結(jié)果提示，腹腔注射內(nèi)膜法形成子宮內(nèi)膜異位癥可能是通過激活A(yù)kt磷酸化、進一步導(dǎo)致其下游靶蛋白Bcl-2、Bax的活化，從而抑制細胞凋亡。但是研究卻發(fā)現(xiàn)，ISCH＋IPC 組Bax表達與ISCH 組并無顯著性差異，有待進一步解釋。

總之，子宮內(nèi)膜缺血能夠抑制子宮內(nèi)膜細胞凋亡，而這一機制可能與Akt信號通路磷酸化以及激活其下游靶蛋白Bcl-2、Bax的活化有關(guān)。

［1］ Liu H，Lang JH.Is abnormal eutopic endometrium the cause of endometriosis？ The role of eutopic endometrium in pathogenesis of endometriosis［J］.Med Sci Monit，2011，17：92-99.

［2］ 徐珍珍.缺血／缺氧預(yù)處理對子宮內(nèi)膜異位癥雞胚模型血管生成的影響［D］.蘇州：蘇州大學(xué)，2009.

［3］ Sampson JA.Peritoneal endometriosis due to menstrual dissemination of endometrial tissue intothe peritoneal cavity［J］.Am J Obstet Gynecol，1927，3：93-110.

［4］ Chen QH，Zhou WD，Su ZY，et al.Change of proinflammatory cytokines follows certain patterns after induction of endometriosis in a mouse model［J］.Fertil Steril，2010，93：1448-1454.

［5］ 陳瓊?cè)A，邱娜璇，顏曉紅，等.BALB／c小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立及其形態(tài)學(xué)的動態(tài)觀察［J］.中國微創(chuàng)外科雜志，2010，10：238-242.

［6］ Li J，Xuan W，Yan R，et al.Remote preconditioning provides potent cardioprotection via PI3K／Akt activation and is associated with nuclear accumulation ofβ-catenin［J］.Clin Sci，2011，120：451-462.

［7］ Ren QZ，Qian ZH，Jia SH，et al.Vascular endothelial growth factor expression up-regulated by endometrial ischemia in secretory phase plays an important role in endometriosis［J］.Fertil Steril，2011，95：2687-2689.

［8］ Bhardwaj A，Sethi G，Vadhan-raj S，et al.Resveratrol inhibits proliferation，induces apoptosis，and overcomes chemoresistance through down-regulation of STAT 3and nuclear factor-kappaB-regulated antiapoptotic and cell survival gene products in human multiple myeloma cells［J］.Blood，2007，109：2293-2302.

［9］ Li J，Xuan W，Yan R，et al.Remote preconditioning provides potent cardioprotection via PI3K／Akt activation and is associated with nuclear accumulation ofβ-catenin［J］.Clin Sci，2011，120：451-462.

［10］ Meijer L，F(xiàn)lajolet M，Greengard P.Pharmacological inhibitors of glycogen synthase kinase 3［J］.Trends Pharmacol Sci，2004，25：471-480.

［11］ Asante A，Taylor RN.Endometriosis：the role of neuroangiogenesis［J］.Annu Rev Phyciol，2011，73：163-182.

［12］ Dmowski WP，Ding J，Shen J，et al.Apoptosis in endome-trial glandular and stromal cells in women with and without endometriosis［J］.Hum Reprod，2001，16：1802-1808.

［13］ Zeng KW，Wang XM，Ko H，et al.Hyperoside protects primary rat cortical neurons from neurotoxicity induced by amyloid p-protein via the PI3K／Akt／Bad／Bcl-XL-regulated mitochondrial apoptotic pathway［J］.Euro J Pharmacol，2011，672：45-55.

［14］ Kroemer G，Reed JC.Mitochondrial control of cell death［J］.Nat Med，2000，6：513-519.

［15］ Meresman GF，Bilotas MA，Lombardi E，et al.Effect of GnRH analogues on apoptosis and release of interleukin-Ibeta and vascular endothelial growth factor in endometrial cell cultures from patients with endometriosis［J］.Hum Reprod，2003，18：1767-1771.

［16］ 王云霞，李亞里，黃靖香.凋亡調(diào)節(jié)基因bcl-2，bax和fas在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2001，26：69-71.

［17］ 周瑞祥，劉昌勤，孫圣剛.鈣拮抗劑對大鼠缺血性腦損傷后Bcl-2和Bax基因表達的作用［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2004，17：195-197.