張躍新，胡 偉**，鄧 勛

（1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040）

瓦尼木層孔菌發(fā)酵液提取物對人結(jié)腸癌LoVo細胞增殖的影響*

張躍新1，胡 偉1**，鄧 勛2

（1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040）

桑黃（Phellinusspp.）是一種珍貴的多年生大型藥用真菌，具有獨特的抗癌功效，是目前國際公認的生物治癌藥劑中效率最高的一種藥用真菌。該文從區(qū)域特種食（藥）用真菌的開發(fā)利用角度出發(fā)，以采自黑龍江完達山的楊樹桑黃即瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii）為研究對象，采用MTT方法比較了水提和酯提方法菌絲發(fā)酵液4個提取物對人結(jié)腸癌LoVo細胞增殖的抑制效果，計算高效提取物最佳作用濃度和IC50，繪制加藥時間與抑制LoVo細胞增殖效果的曲線。研究結(jié)果表明，不同處理方法獲得的提取物對人結(jié)腸癌LoVo細胞增殖的抑制效果差異顯著，其中酯提效果好于水提，在1000 μg·mL-1濃度條件下，加藥48 h后，正丁醇提取樣品對人結(jié)腸癌LoVo細胞抑制率最高為86.8%，乙酸乙酯提取樣品抑制率為87.5%，超聲波提取樣品對人結(jié)腸癌LoVo細胞抑制率為58.3%，直接水提效果最差，只有57.8%；桑黃菌絲體發(fā)酵液乙酸乙酯提取物IC50為53.459 μg·mL-1，在此濃度下，加藥后96 h抑制率達到90%以上，加藥120 h抑制率達95%，抑制率也隨著加藥時間的增加而提高。這為探求瓦尼木層孔菌資源價值的科學評價與有效開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的學術(shù)和現(xiàn)實意義。

瓦尼木層孔菌；菌絲體發(fā)酵液粗提物；MTT法；LoVo細胞增殖；抑制作用

桑黃是一大類具有重要藥用價值的大型真菌，目前所述桑黃均屬木層孔菌屬（Phellinusspp.），層孔菌屬目前已發(fā)現(xiàn)251種左右，中國發(fā)現(xiàn)62種[1]。瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii）又稱楊樹桑黃，隸屬擔子菌綱 （Basidiomycetes） 非褶菌目 （Aphyllophorales）銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）木層孔菌屬（Phellinus）[2]。最早在20世紀60年代被發(fā)現(xiàn)于俄羅斯的遠東地區(qū)[3]，在我國主要分布在東北地區(qū)包括吉林省的長白山、黑龍江省的小興安嶺以及黑龍江省以東烏蘇里江與興凱湖之間的完達山、老爺嶺等地區(qū)。主要生長在山楊活立木或倒木上，故稱楊樹桑黃[4-8]。與主要“桑黃”品種 [火木層孔菌（Phellinus igniarius）、裂蹄木層孔菌（Phellinus linteus）和鮑氏針層孔菌（Phellinus baumii）]具有相近分布區(qū)域、且質(zhì)地外觀比較相似的另外一種多年生兼性腐生菌。

“桑黃”是目前國際公認的生物治癌領(lǐng)域中有效率最高的一種藥用真菌[9-12]，對多種癌細胞的生物測定均有顯著抑制作用。其活性成分提取物具有顯著的抗癌功效，Ikekawa等[13]發(fā)現(xiàn)，桑黃野生子實體的提取物對小白鼠肉瘤S180的抑制率為95.7%，通過提取桑黃的有效成分對癌細胞的直接殺滅效果接近100%的效果，從而使桑黃的抗癌作用引起關(guān)注。Sasaki等[14]發(fā)現(xiàn)桑黃中發(fā)揮抗癌作用的物質(zhì)為多糖，目前，已從桑黃中分離出30多種單體化合物，分別屬于黃酮類、香豆素類、甾醇類、萜類等。提取溶劑和方法的不同，會影響提取物的抗癌效果，Jong MH[15]采用浸提法比較了甲醇、氯仿、正丁醇和水對桑黃子實體的提取效率，結(jié)果表明，正丁醇提取率最好，其浸提物抗耐甲氧基西林金黃色葡萄球菌效果最好（MIC：63 μg·mL-1～125 μg·mL-1）。Ajith等[16]研究了桑黃乙酸乙酯、甲醇和水的提取物，然后分別用來抗Dalton淋巴腹水癌和Ehrlich腹水癌，發(fā)現(xiàn)水提物對它們沒有細胞毒素作用，而這三個提取物對DLA引起的小鼠腫瘤細胞有顯著的生長抑制作用，并且乙酸乙醋的提取物效果最好，在劑量為50mg·kg-1口服給藥就可以和臨床標準參考藥順鉑4mg·kg-1的靜脈注射效果相當。

楊樹桑黃同樣具有抑制腫瘤功效，并對脾胃虛弱、消化不良等也有良好的治療作用，是一種極具開發(fā)價值的珍貴藥用真菌[3]。筆者自90年末開始瓦尼木層孔菌資源環(huán)境調(diào)查與人工培育方面的研究[17]，分離得到多株楊樹桑黃菌株，并且成功實現(xiàn)的人工栽培，獲得子實體，為進一步優(yōu)化栽培工藝，規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，本試驗從區(qū)域特種食藥用真菌的開發(fā)利用角度出發(fā)，以采自黑龍江完達山地區(qū)的瓦尼木層孔菌馴化菌株為研究對象，通過不同方法提取菌絲發(fā)酵液中的活性成分，采用MTT法研究其對人結(jié)腸癌LoVo細胞增殖的抑制效果，為探求區(qū)域性珍貴藥用真菌瓦尼木層孔菌的科學評價與有效開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料和方法

1.1實驗材料

人結(jié)腸癌LoVo細胞購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤研究所細胞庫。

MTI（四甲基偶氮唑藍）為SIGMA公司產(chǎn)品。DMEM細胞培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素（100 U）雙抗溶液均為Hyclone公司產(chǎn)品。優(yōu)級胎牛血清購自天津灝陽生物有限公司。胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。

供試菌株為瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii）分離自黑龍江省完達山區(qū)，保存于東北林業(yè)大學森林微生物研究中心。

葡萄糖、瓊脂、MgSO4·7H2O、KH2PO4、正丁醇、乙酸乙酯等均為分析純試劑，購于化學試劑公司；RPMI 1640購于美國GIBCO公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購于NQBB公司；DMSO、MTT購自索萊寶。胰酶由哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤研究所實驗室提供。

1.2桑黃菌絲體發(fā)酵液提取物的制備

菌株發(fā)酵：將保存的菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中進行活化。用10 mm無菌打孔器切取活化好的菌株菌片，接種到裝有300 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶（500 mL） 內(nèi)，每瓶接種6片，25℃、轉(zhuǎn)速160 r·min-1搖床中培養(yǎng)15 d，得到菌絲體發(fā)酵液。

發(fā)酵液提取物的制備：對菌絲體發(fā)酵液采用水提和酯提2種方式。

水提樣品的制備：采用直接提取法及超聲波提取法2種方法。將菌絲體發(fā)酵液用8層無菌紗布過濾，得到直接水提樣品；將菌絲體發(fā)酵液經(jīng)超聲波振蕩提取50 min后，用無菌紗布過濾，取濾液，得到超聲波提取樣品，上述樣品均經(jīng)冷凍干燥機（-50℃）處理24 h，得到粉末狀粗提物，4℃冷藏保存，使用前1000 r·min-1、4℃離心5 min，經(jīng)Milles-HV Filter Unit除菌濾膜（直徑0.22 μm）過濾除菌后進行抑制癌細胞生長測試。

酯提樣品的制備：將菌絲體發(fā)酵液用無菌紗布過濾后，分別與正丁醇、乙酸乙酯按1/3（體積比）比例混合，常溫下靜止放置5 d后分液去掉下層水相濾液，將上層有機溶劑分別在60℃、40℃條件下，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后得到固體樣品。

粗提物均用二甲基亞砜（DMSO）（終濃度＜1‰）助解，加RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，配成2 000 μg·mL-1樣品準備液，無菌條件下用Milles-HV Filter Unit除菌濾膜（直徑0.22 μm）過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細胞復蘇培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存管37℃水浴1 min，無菌條件下從凍存管內(nèi)吸出細胞懸液，放入離心管中，加4 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)液，1000 r·min-1離心5 min，棄上清，加少許RPMI 1640完全培養(yǎng)液，吹打均勻后注入含有RPMI 1640完全培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在癌細胞生長過程中，每一至兩天對培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液進行更換。待細胞密度生長至瓶壁80%時，倒去培養(yǎng)基，以0.25%胰蛋白酶消化瓶中細胞2 min～3 min，倒去胰蛋白酶溶液，加入少量RPMI 1640完全培養(yǎng)液，沖下壁上所有細胞，吸入離心管中，并加入8 mL PBS用吸管混勻，1000 r·min-1離心3 min棄上清。加入少量RPMI 1640完全培養(yǎng)液將細胞懸起以1∶2傳代。

1.4MTT法檢測瓦尼木層孔菌提取物對腫瘤細胞的細胞毒活性

主要測定不同提取方法和不同濃度瓦尼木層孔菌提取物對腫瘤細胞的細胞毒活性[18-19]。

取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，1000 r·min-1離心3 min。制備單細胞懸液，并調(diào)整濃度為3×104mL，以100 μL·孔-1接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。每孔加入不同藥物10 μL，再加入新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)液90 μL，使其藥物終濃度分別為103μg·mL-1、102μg·mL-1、10 μg·mL-1、1 μg·mL-1。平行設空白對照組（用等體積的RPMI 1640完全培養(yǎng)液代替受試藥物），每組重復5個復孔。再培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μLMTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μLDMSO，震蕩10 min。用酶標儀在490 nm波長檢測OD值，根據(jù)OD值計算細胞抑制率CI（cytotoxic index，毒性指數(shù)，單位%）。抑制率正值表示對細胞有殺傷作用，負值表示對細胞有促增殖作用，比較不同處理方式的提取物對腫瘤細胞的抑制效果，同時初步確定有效的濃度范圍。

CI=(1-OD1/OD0)×100%

式中：OD1表示試驗組OD值；OD0表示對照組OD值。

在確定最佳提取方式和有效的濃度范圍后，同樣采用MTT法篩選提取物的最佳濃度，方法同上，處理中使其藥物終濃度分別為100 μg·mL-1、80 μg·mL-1、60 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1，測定對腫瘤細胞的細胞毒活性，篩選最佳濃度。

1.5最佳受試藥物抑制LoVo細胞增殖與加藥時間的關(guān)系

取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，1000 r·min-1離心3 min。制備單細胞懸液，將其濃度調(diào)整為3×104·mL-1，以100 μL·孔-1接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。加入瓦尼木層孔菌乙酸乙酯提取物藥劑（IC50=53.459 μg·mL-1），再加入新鮮的RPMI 1640完全培養(yǎng)液90 μL。平行設空白對照組（用等體積的RPMI1640完全培養(yǎng)液代替受試藥物），每個組5個復孔。通過上面的試驗，確定最佳濃度以及提取方式。

分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后，每孔加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μLDMSO，震蕩10 min。用酶標儀在490 nm波長檢測光吸收值（OD），根據(jù)OD值計算細胞抑制率CI。根據(jù)抑制率與加藥時間制作抑制曲線。

1.6數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s） 表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，由SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。

2 結(jié)果與分析

2.1不同方法瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液提取物對腫瘤細胞的抑制作用

瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液4種提取物作用LoVo細胞48 h的光吸收值（OD值）和抑制率（CI）見表1。

表1 瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液不同提取物作用LoVo細胞48 h的OD值和抑制率（CI）Tab.1 OD value and the inhibition rate of different extracts of mycelium fermented broth of Phellinus vaninii for 48 h on tumor LoVo cells

由表1可見，4種方法制備的瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液提取物對人結(jié)腸癌LoVo細胞的增殖均有一定抑制效果。其中正丁醇和乙酸乙酯的酯提物的抑制效果好于直接水提和超聲波提取物。低濃度的提取物對LoVo細胞的抑制效果不明顯，甚至有促進細胞增殖的作用。隨著濃度的增高，對LoVo細胞的抑制率逐漸增加，在最佳濃度1000 μg·mL-1濃度條件下，加藥48 h后，正丁醇提取樣品對人結(jié)腸癌LoVo細胞抑制率最高為86.8%；乙酸乙酯提取樣品抑制率為87.5%；超聲波提取樣品對人結(jié)腸癌LoVo細胞抑制率為58.3%；直接水提效果最差，只有57.8%。正丁醇和乙酸乙酯提取物雖然抑制效果相差不大，但是正丁醇在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時的溫度為60℃，而乙酸乙酯只有45℃，綜合考慮制備工藝和對LoVo細胞的抑制效果，選擇乙酸乙酯提取液進行進一步的濃度篩選。

2.2瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液乙酸乙酯提取物最佳作用濃度的篩選

設定在1 μg·mL-1～100 μg·mL-1濃度區(qū)間，測定不同濃度的乙酸乙酯提取物對LoVo細胞的抑制效果，見表2。

表2 瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液乙酸乙酯提物不同濃度作用LoVo細胞48 h的OD值和抑制率（CI）Tab.2 Each group’s OD value and the inhibition rate of different concentration of mycelium fermented broth extract of Phellinus vaninii for 48 h on tumor LoVo cells

由表2可見，濃度為80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液乙酸乙酯提取物加藥48 h，對人結(jié)腸癌LoVo細胞的抑制率分別為79.9%和82.2%，與對照相比差異均極顯著。通過回歸分析，計算IC50值為53.459 μg·mL-1。

2.3最佳濃度和提取方式對腫瘤細胞抑制與時間的關(guān)系

瓦尼木層孔菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對人結(jié)腸癌LoVo細胞的抑制率與加藥時間呈正比關(guān)系，隨著加藥時間的延長，其抑制效果越明顯。藥物作用96 h之前，加藥時間與對細胞的抑制率呈一定的線性關(guān)系，在96 h時抑制率就達到了90%以上。加藥120 h時，對癌細胞的抑制率幾乎到達了100%，見圖1。

3 結(jié)論與討論

本文乙酸乙酯作為高效的提取溶劑的研究結(jié)果與Ajith等[19]用桑黃乙酸乙酯、甲醇和水的提取物，分別用來抗Dalton淋巴腹水癌和Ehrlich腹水癌，發(fā)現(xiàn)乙酸乙醋的提取物效果最好的結(jié)果相同。乙酸乙酯作為高效的提取溶劑在天然活性成分的提取中應用廣泛。

圖1 瓦尼木層孔菌乙酸乙酯提取物對腫瘤LoVo細胞抑制率及其時間關(guān)系Fig.1 Relationship between the inhibition effect and the administration time of ethyl acetate extract of mycelium fermented broth of Phellinus vaninii on tumor LoVo cells

本文采用不同處理方法獲得的瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液提取物對人結(jié)腸癌LoVo細胞增殖的抑制效果差異顯著，其中酯提效果好于水提，在1000 μg·mL-1濃度條件下，加藥48 h后，正丁醇提取樣品對人結(jié)腸癌LoVo細胞抑制率最高為86.8%，乙酸乙酯提取樣品抑制率為87.5%，超聲波提取樣品對人結(jié)腸癌LoVo細胞抑制率為58.3%，直接水提效果最差，只有57.8%。通過回歸分析，瓦尼木層孔菌菌絲體發(fā)酵液乙酸乙酯提取物IC50為53.459 μg·mL-1，在此濃度下，加藥后96 h抑制率達到90%以上，加藥120 h抑制率達95%。抑制率也隨著加藥時間的增加而提高。

與桑黃相同，楊樹桑黃的活性成分在抗癌研究中，作用明顯。作為一類分布地域性很強的大型真菌，從區(qū)域特種食藥用真菌的開發(fā)利用角度出發(fā)具有極大的開發(fā)和研究價值。本文為探求瓦尼木層孔菌資源價值的科學評價與有效開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的學術(shù)和現(xiàn)實意義。深入研究楊樹桑黃的活性成分的分離純化工藝及其作用機理是今后亟待開展的工作。

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Effect of Mycelium Fermented Broth of Phellinus vaninii on the Proliferation of Colon Cancer LoVo Cells

ZHANG Yue-xin1,HU Wei1,DENG Xun2
(1.Heilongjiang Forest By-product and Speciality Institute,Mudanjiang 157011,China；2.Heilongjiang Forestry Protect Institute,Harbin 150040,China)

Phellinusspp.is a valuable,perennial and macro medicinal mushroom with a unique anticancer efficacy and is one of the most efficient and internationally recognized medicinal mushroom among the biological drugs in the cure of cancer.From the view of the development and utilization of regional special edible-medicinal mushroom,taking thePhellinus vaniniicollected from the region of Wanda Mountains in Heilongjiang province as the research object,the inhibition effect of 4 mycelium fermented broth extracts on the proliferation of colon cancer LoVo cells by water extract and ethyl acetate extract with the MTT assay was compared.The best concentration and IC50of efficient extract were calculated and the administration time and inhibition effect of proliferation of LoVo cells were determined.The results showed that the difference of the inhibiting effect of the extracts obtained by different methods on the proliferation of colon cancer LoVo cells was significant.Among them,the effect of ethyl acetate extract was better than water extract.At the concentration of 1000 μg·mL-1and 48 h after the medicine,the highest inhibition rate of butanol extract samples on colon cancer LoVo cells was 86.8%,which of ethyl acetate extract samples was87.5%,the inhibition rate of ultrasonic bath extract was 58.3%and the effect of direct water extract was the worst,only 57.8%. The IC50of the ethyl acetate extract of mycelium fermented broth of Phellinus vaninii was 53.459 μg·mL-1.At the concentration and 96 h after the medicine,the inhibition rate was more than 90%,120 h after the medicine,the inhibition rate was 95%and increases with the medicine time.It laid the foundation for seeking the scientific evaluation and the effective development of resources value of Phellinus vaninii and had an important academic value and realistic importance.

Phellinus vaninii;mycelium fermented broth extracts;MTT assay;inhibition effect of proliferation of LoVo cells

S646.9

A

1003-8310（2015）04-0062-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.015

黑龍江省財政廳自擬項目（2015-01）。

張躍新（1980-），男，碩士，助理研究員，主要從事食藥用真菌資源開發(fā)研究。E-mail:robertn@163.com

*通信作者：胡偉（1964-），男，博士，研究員，主要從事大型真菌資源開發(fā)利用研究。E-mail:huwei64057@163.com

2015-04-30