林 輝，賴淑芳，鄭珠霜，王麗芬，陳桂珍，朱傳進(jìn)，萬春和，孫淑靜，胡開輝**

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)（古田）菌業(yè)研究院，福建 古田 352200；3.古田食用菌研發(fā)中心，福建 古田 352200）

〈生理生化〉

香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)過程中酶系的相互作用*

林 輝1，2，賴淑芳1，鄭珠霜1，王麗芬2，3，陳桂珍2，3，朱傳進(jìn)2，3，萬春和1，孫淑靜1，2，胡開輝1，2**

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)（古田）菌業(yè)研究院，福建 古田 352200；3.古田食用菌研發(fā)中心，福建 古田 352200）

該實(shí)驗(yàn)對純香灰菌（Hypoxylon sp.）培養(yǎng)及其與銀耳（Tremella fuciformis）混合培養(yǎng)過程中的纖維素酶、淀粉酶、漆酶等培養(yǎng)原料基質(zhì)降解相關(guān)酶變化規(guī)律進(jìn)行了比較與分析。結(jié)果表明，香灰菌長滿菌袋后淀粉酶與漆酶活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸下降，木聚糖酶活力在培養(yǎng)至15 d達(dá)到最大值5 000 U·mL-1，纖維素酶活力培養(yǎng)至5 d后，穩(wěn)定在40 U·mL-1左右，可以有效降解木料培養(yǎng)基。銀耳與香灰菌混合培養(yǎng)后，在固體培養(yǎng)過程中，其中胞外可溶性蛋白濃度和木聚糖酶、纖維素酶活力變化規(guī)律與香灰菌純培養(yǎng)相似，而淀粉酶在培養(yǎng)至第10天達(dá)到最大值2 253 U·mL-1，其胞外可溶性蛋白濃度與木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶活力顯著提高，漆酶活力培養(yǎng)至第5天達(dá)到最大值71.33 U·mL-1，隨后迅速下降，蛋白酶活力變化情況與淀粉酶相似，第15天酶活力達(dá)到最大值3.05 U·mL-1。說明混合培養(yǎng)中兩者具有互作效應(yīng)，可以有效促進(jìn)胞外蛋白的分泌，提高基質(zhì)降解相關(guān)酶活力，促進(jìn)菌體對基質(zhì)的降解，提高養(yǎng)分的供應(yīng)。該結(jié)果可為銀耳優(yōu)良菌種的選育，兩者的配比以及栽培料的選擇與優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

香灰菌；銀耳；基質(zhì)；降解；酶活

銀耳（Tremella fuciformis）生活史復(fù)雜，自身沒有分解木質(zhì)纖維素與淀粉基質(zhì)的能力，不能單獨(dú)在木質(zhì)纖維素上生長，只有與香灰菌進(jìn)行共生培養(yǎng)時(shí)才能正常生長發(fā)育[1-2]。香灰菌（Hypoxylonsp.）是銀耳的伴生菌，在銀耳的培養(yǎng)過程中，可以分泌基質(zhì)降解酶對栽培料基質(zhì)進(jìn)行分解，為銀耳的生長發(fā)育提供營養(yǎng)。目前有學(xué)者[3-4]就香灰菌菌液對銀耳菌絲生長作用以及不同香灰菌傳代次數(shù)對銀耳栽培的影響進(jìn)行了研究，表明了香灰菌的代謝產(chǎn)物對銀耳菌絲的穩(wěn)定生長具有促進(jìn)作用，并且隨著香灰菌傳代次數(shù)的增加羧甲基纖維素酶以及漆酶活性逐漸下降，混合培養(yǎng)過程中銀耳的生長周期延長，產(chǎn)量與品質(zhì)下降。但純香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)過程中的基質(zhì)降解相關(guān)酶活測定還未見報(bào)道。為尋找銀耳栽培過程中銀耳菌種的質(zhì)量與穩(wěn)定性以及與相關(guān)酶活的變化規(guī)律，建立銀耳菌種質(zhì)量的內(nèi)控指標(biāo)，以及為栽培料的優(yōu)化提供判斷依據(jù)，本研究對純香灰菌培養(yǎng)及其與銀耳混合培養(yǎng)過程中的纖維素酶、漆酶體系（漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶）、木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶活力的變化進(jìn)行了測定，探明香灰菌培養(yǎng)過程中自身的基質(zhì)分解相關(guān)酶活性，旨在揭示香灰菌在銀耳培養(yǎng)中在基質(zhì)分解方面的作用，找出香灰菌基質(zhì)降解酶活變化與銀耳生長發(fā)育的相關(guān)性，從而為優(yōu)良菌種的選育和銀耳栽培料的優(yōu)化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1菌種

銀耳純菌絲和香灰菌純菌絲，均為福建農(nóng)林大學(xué)（古田）菌業(yè)研究院保藏菌種。

1.2試供培養(yǎng)基

1.2.1 PDA培養(yǎng)基（加富）

土豆（去皮）200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、酵母提取粉3g、硫酸鎂1.5g、磷酸二氫鉀1.5g、維生素B10.1g、瓊脂20g，加水定容至1000 mL，pH自然。

1.2.2 栽培料

木屑培養(yǎng)基：木屑78%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%（含水量60%）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

栽培料加水混勻后過夜堆料，次日裝袋（35 mm×90 mm），每袋濕重60%。121℃滅菌120 min，冷卻后按5%接入原種，接種完的菌袋放入25℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，一定時(shí)間測定菌袋失重情況。

1.3.2 樣品前處理

自菌袋長滿菌絲開始（25 d），每隔5 d將整袋栽培料倒入不銹鋼鍋，充分混勻即可取樣，每次取樣3袋。準(zhǔn)確稱取20 g栽培料置于60℃烘干箱烘干，另取10 g用于制備粗酶液。

1.3.3 粗酶液的制備

栽培料全部取出攪拌均勻后，稱取10 g于100 mL三角瓶中，加入50 mL雙蒸水，150 r·min-1，25℃恒溫振蕩搖床培養(yǎng)90 min后，經(jīng)紗布過濾后，9 000 r·min-1離心15 min，取上清液即為粗酶液。

1.4pH值與總糖的測定

將制備好的粗酶液，使用pH計(jì)測定溶液pH值。準(zhǔn)確稱取0.15 g烘干后的栽培料，加入1.5 mL濃鹽酸與5 mL雙蒸水沸水浴3 h。8 000 r·min-1離心10 min，取上清后將沉淀重復(fù)2次操作，匯合3次溶液后定容至50 mL，使用硫酸-苯酚法測定糖濃度。

1.5酶活測定

相關(guān)酶活測定：纖維素酶活力參照文獻(xiàn) [5]；木聚糖酶活力參照文獻(xiàn) [6]；中溫-α-淀粉酶活力測定參照文獻(xiàn) [7]；中性蛋白酶活力測定參照文獻(xiàn) [8]；漆酶活力測定參照文獻(xiàn) [9]；木質(zhì)素過氧化物酶活力測定參照文獻(xiàn) [10]；錳過氧化物酶活力測定參照文獻(xiàn) [11]。

2 結(jié)果

2.1香灰菌滿袋后的總糖與pH值變化分析

香灰菌滿袋后培養(yǎng)過程中栽培料總糖和pH值的變化情況見圖1。

圖1 香灰菌培養(yǎng)過程中栽培料總糖與pH變化曲線Fig.1 Changing of total sugar and pH in cultivation material duing the Hypoxylon sp.cultivation

由圖1可以看出，香灰菌菌袋長滿后，栽培料中的總糖隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，以0.5%（總糖/料干重）左右的速率逐漸下降。培養(yǎng)35 d，總糖共下降18%。其總糖用于菌絲的生長、呼吸作用以及合成相關(guān)物質(zhì)，菌袋重量也有所減輕。栽培料的pH略有上升，從菌袋長滿到第10天，pH值由5.3上升到5.5，栽培10 d以后，菌袋中栽培料的pH值基本不變，維持在5.5～5.6。pH值的略有上升可能是香灰菌在生長過程中對栽培料中的酸性物質(zhì)的利用所致。

2.2香灰菌滿袋后與銀耳混合培養(yǎng)過程中的酶活力變化

2.2.1 纖維素酶活力變化分析

香灰菌滿袋后與銀耳混合培養(yǎng)過程中纖維素酶活力變化情況見圖2。

圖2 香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)過程中纖維素酶活力變化Fig.2 Activity of cellulase produced by Hypoxylon sp.and Tremella fuciformis mixed cultivation incultivation material

木屑、棉籽殼是銀耳栽培的主要原料，具有豐富的纖維素與半纖維素，在纖維素酶的作用下纖維素分解成葡萄糖，為碳水化合物和氨基酸構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和供給食用菌生長發(fā)育所需的能量，因此纖維素酶活的變化可反映食用菌對培養(yǎng)基質(zhì)的降解能力。

由圖2可以看出隨著香灰菌菌袋菌絲長滿，纖維素酶酶活力從20 U·mL-1至長滿菌袋5 d后穩(wěn)定在40 U·mL-1左右，持續(xù)的降解纖維素為菌絲生長和出菇提供所需營養(yǎng)。香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)后，培養(yǎng)至20 d纖維素酶活力達(dá)到210 U·mL-1，纖維素酶活力顯著提高，相對于香灰菌純培養(yǎng)酶活力提高了5倍，由此可見銀耳與香灰菌混合培養(yǎng)后，大大提高了銀耳對原料中纖維素的降解能力。

2.2.2 淀粉酶和木聚糖酶活力變化分析

香灰菌滿袋后與銀耳混合培養(yǎng)過程中淀粉酶和木聚糖酶酶活力變化情況見圖3。

圖3 香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)過程中淀粉酶、木聚糖酶活力變化Fig.3 Activity of amylase and xylanase produced by Hypoxylon sp. and Tremella fuciformis mixed cultivation in cultivation material

淀粉酶可以降解栽培料中的淀粉類多糖為單糖作為菌絲生長、代謝的能量來源，木聚糖酶可有效降解培養(yǎng)料中如麩皮等糠麩類飼料中的木聚糖（木聚糖是半纖維素的主要成分）。

由圖3可以看出香灰菌在生長過程中具有很高的淀粉酶活力。當(dāng)菌絲長滿菌袋后，淀粉酶活力高達(dá)900 U·mL-1，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，栽培料中的淀粉酶活力逐漸減低，培養(yǎng)至25 d后降低到500 U·mL-1左右。香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)后淀粉酶酶活力大大提高，培養(yǎng)至第10天淀粉酶活力穩(wěn)定在2 253 U·mL-1左右。香灰菌在長滿菌袋后木聚糖酶活力高達(dá)1000 U·mL-1，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，其酶活力繼續(xù)升高，培養(yǎng)至15 d后達(dá)到最大值5 000 U·mL-1；混合培養(yǎng)后的木聚糖酶活力明顯提高，培養(yǎng)至25 d酶活力高達(dá)8 575 U·mL-1。可見混合培養(yǎng)后，淀粉酶與木聚糖酶酶活力相對香灰菌單純培養(yǎng)提高明顯，加強(qiáng)了銀耳培養(yǎng)過程中對栽培料中淀粉類和半纖維素多糖的利用。

2.2.3 中性蛋白酶活力與胞外可溶性蛋白濃度變化

香灰菌滿袋后與銀耳混合培養(yǎng)過程中胞外可溶性蛋白濃度和中性蛋白酶酶活力變化情況見圖4。

圖4 香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)過程中胞外可溶性蛋白濃度和蛋白酶酶活力變化Fig.4 Extracellular soluble protein and activity of protease produced by Hypoxylon sp.and Tremella fuciformis mixed cultivation in cultivation material

蛋白酶可以將蛋白質(zhì)分解成氨基酸、尿素、氨等小分子化合物后進(jìn)行吸收并將其用于合成蛋白質(zhì)和核酸，為菌絲的生長提供原料。其中纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶等基質(zhì)降解酶均為胞外可溶性降解酶，基質(zhì)降解酶是胞外酶的重要組成成分之一。

由圖4可以看出香灰菌在培養(yǎng)過程中蛋白酶活力很低，菌絲剛長滿袋后僅達(dá)到5 U·mL-1；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，栽培料中蛋白酶活力逐漸降低，長滿25 d后其酶活力僅在1 U·mL-1左右。香灰菌與銀耳混合培養(yǎng)后，胞外蛋白酶活力最大僅達(dá)到3.05 U·mL-1。香灰菌菌袋長滿后胞外可溶性蛋白濃度由80 μg·mL-1增長到110 μg·mL-1，而混合培養(yǎng)后，栽培料中的胞外可溶性蛋白濃度培養(yǎng)至第15天后穩(wěn)定在235 μg·mL-1左右?？梢娤鄬ο慊揖兣囵B(yǎng)，香灰菌與銀耳的混合培養(yǎng)可以降低胞外蛋白酶的合成，提高胞外酶的分泌。

2.2.4 漆酶體系（漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶）酶活力

香灰菌滿袋后與銀耳混合培養(yǎng)過程中漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶活力變化情況見圖5、表1。

圖5 香灰菌培養(yǎng)過程中漆酶、錳過氧化物酶與木質(zhì)素過氧化物酶酶活力變化Fig.5 Activity of laccase,manganese peroxidase and lignin peroxidase produced by Hypoxylon sp.in cultivation material

表1 混合培養(yǎng)過程胞外蛋白濃度和基質(zhì)降解相關(guān)酶活力Tab.1 Activity of laccase,manganese peroxidase and lignin peroxidase produced by Hypoxylon sp.and Tremella fuciformis mixed cultivation in cultivation material

漆酶是一種與木質(zhì)素分解相關(guān)的多酚氧化酶，在食用菌生長周期中分解木質(zhì)素，為菌絲提供營養(yǎng)物質(zhì)，另外，漆酶的代謝產(chǎn)物醌能增強(qiáng)菌種的抗病能力，抑制雜菌的污染。

通過測定表明，香灰菌菌絲長滿菌袋后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加漆酶活性迅速降低，5 d～15 d酶活力提高到25 U·mL-1后又迅速降低，培養(yǎng)至25 d后檢測不到漆酶的活性?；旌吓囵B(yǎng)后，漆酶活力在培養(yǎng)第5天達(dá)到最大值71.33 U·mL-1后迅速下降，培養(yǎng)至15 d后檢測不到漆酶的活性。兩種培養(yǎng)均檢測不到錳過氧化物酶與木質(zhì)素過氧化物酶酶活性。

3 小結(jié)與討論

王玉萬和梁勤等[12-13]對銀耳研究結(jié)果表明，銀耳自身在培養(yǎng)過程中并不能產(chǎn)生纖維素酶并對栽培料中的纖維素進(jìn)行降解，混合培養(yǎng)后栽培料中的纖維素酶酶活有了明顯的提高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與這一結(jié)論一致：香灰菌純培養(yǎng)的栽培料中纖維素酶活力達(dá)到40 U·mL-1，混合培養(yǎng)后的酶活提高到210 U·mL-1。菌袋長滿后的栽培料中，木聚糖酶與淀粉酶活力最為明顯，其中木聚糖酶酶活力高達(dá)5 000 U·mL-1以上，淀粉酶酶活力也達(dá)到2 000 U·mL-1。其中淀粉酶活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸下降。這一結(jié)果與對香菇與金針菇等食用菌的研究結(jié)果相似[14-15]。而木聚糖酶活力達(dá)到最高后隨著培養(yǎng)天數(shù)延長逐漸下降，這一現(xiàn)象又與對平菇研究結(jié)果相似[16-17]。本文漆酶活性迅速下降后，又有所上升，這一規(guī)律與對金針菇的培養(yǎng)過程研究相似[15]。因此香灰菌在培養(yǎng)過程中可以很好地在栽培過程中降解木質(zhì)素、木聚糖和淀粉等基質(zhì)中的碳源，有效地為銀耳的生長提供營養(yǎng)。相對香灰菌純培養(yǎng)，混合培養(yǎng)栽培料中除了蛋白酶酶活力外，纖維素酶酶、木聚糖酶、漆酶和淀粉酶酶活力均顯著提高，加快對基質(zhì)的降解速率。這一現(xiàn)象也與王玉萬研究結(jié)果相同[12]。從胞外可溶性蛋白濃度可以看出，混合培養(yǎng)栽培料的蛋白濃度高達(dá)香灰菌純培養(yǎng)的2倍，因此混合培養(yǎng)可以明顯促進(jìn)菌絲胞外酶的分泌，提高基質(zhì)降解酶的活力。以上的結(jié)果可以說明香灰菌在基質(zhì)降解方面對銀耳有重要作用，兩者之間存在著明顯的相互作用關(guān)系，可以為兩者優(yōu)良菌種的選育，栽培過程中兩者之間的配比以及培養(yǎng)料的優(yōu)化提供重要的參考。

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紫芝基因組精細(xì)圖完成發(fā)布

據(jù)悉，教育部長江學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人陳士林領(lǐng)導(dǎo)的課題組日前完成了紫芝基因組精細(xì)圖，該精細(xì)圖含有12條染色體，序列總長度達(dá)到48.86兆堿基，編碼大約1.5萬個(gè)基因。相關(guān)研究成果已發(fā)表在自然出版集團(tuán)旗下期刊《科學(xué)報(bào)道》上。

課題組研究表明，紫芝在生長發(fā)育中具有多種防御機(jī)制，包括基因組防御機(jī)制和化學(xué)防御機(jī)制，紫芝的化學(xué)防御功能可能受到多種基因調(diào)控機(jī)制影響?；蚪M防御對于維持物種遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性具有重要意義，而化學(xué)防御與其次生代謝產(chǎn)物的合成與調(diào)控具有密切關(guān)系。

靈芝基因組圖譜的公布為開展靈芝三萜等有效成分的合成研究提供了便利，隨著這些合成途徑的逐步解析，使得通過合成生物學(xué)合成靈芝有效成分成為可能。同時(shí)，對靈芝生長發(fā)育和抗病抗逆關(guān)鍵基因的研究探索，將推動靈芝的基因組輔助育種研究，加速靈芝新品種的培育，為靈芝產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展提供了科技支撐。

中國食用菌商務(wù)網(wǎng)

2015.07.03

Interaction Rules of Enzyme System between Hypoxylon sp.and Tremella fuciformis

LIN Hui1，2,LAI Shu-fang1,ZHENG Zhu-shuan1,WANG Li-fen2，3,CHEN Gui-zhen2，3, ZHU Chuan-jin2，3,WAN Chun-he1,SUN Shu-jing1，2,HU Kai-hui1，2
(1.College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.Edible Fungi Research Institute (Gutian),Fujian Agriculture and Forestry University,Gutian 350002,China; 3.Edible Fungi Research and Development Center of Gutian,Gutian 350002,China)

In order to study the interaction rules of enzyme system betweenHypoxylonsp.andTremella fuciformis,the substrate degradation related enzymes about theHypoxylonsp.and mixed strain cultivation (T.fuciformisandHypoxylonsp.)were determined and analyzed.The results showed that the amylase and laccase activity ofHypoxylonsp.reduced during the culture period.However,the activity of xylanase reached the peak of 5 000 U·mL-1at the 15thday,while the cellulase activity increased and reached the peak of 40 U·mL-1after the 5thday,which could degrade the wood culture medium effectively.Thechanging rule of soluble extracellular protein concentration,xylanase and cellulase in medium by mixed strain cultivation had similar trend withHypoxylonsp.,while the amylase reached the peak of 2 253 U·mL-1at the 10thday and soluble extracellular protein concentration and xylanase,cellulose,amylase activity increased obviously.The laccase activity reached the peak of 71.33 U·mL-1at the 5thday and then declined sharply.The changing rule of proteinase activity was similar with amylase which reached the peak of 3.05 U·mL-1at the 15thday.The results indicated that the interaction in mixed strain cultivation not only promote the secretion of extracellular protein,but also it improve the substrate degradation related enzyme activity,and increase the ability of degradation for the substrate.The results lay good foundation for theT.fuciformisbreeding,such as the ratio and the culture medium for theHypoxylonsp.and theT.fuciformis.

Hypoxylonsp;Tremella fuciformis;substrate;degradation;enzyme activity

S646.9

A

1003-8310（2015）04-0057-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.014

福建省高校產(chǎn)學(xué)研重大項(xiàng)目（2013N5004）；珍稀食用菌品種（真姬菇、繡球菌） 創(chuàng)新與自動化生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工程項(xiàng)目（2014S1477-8）；福建省食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)重大研發(fā)平臺（2014N2101）。

林輝（1990-），男，碩士，助理研究員，主要從事食用菌開發(fā)與利用方面研究。E-mail:13489943760@163.com

**通信作者：胡開輝（1962-），男，碩士，教授，主要從事真姬菇的應(yīng)用、開發(fā)與工廠化方面研究。E-mail:2692609765@qq.com

2015-04-20