范可章，陳 靈，張 振，蔡 健**

（1.阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.阜陽市寧老莊高級職業(yè)中學(xué)，安徽 阜陽 236036）

〈栽培技術(shù)〉

平菇菌種液體培養(yǎng)質(zhì)量的影響因素分析*

范可章1，陳 靈2，張 振2，蔡 健1**

（1.阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.阜陽市寧老莊高級職業(yè)中學(xué)，安徽 阜陽 236036）

為了解平菇菌種液體培養(yǎng)中各種因素對培養(yǎng)質(zhì)量的影響，以黑平209為試驗材料，以檢測單位體積發(fā)酵液菌絲體干重及其蛋白含量為判斷依據(jù)。采用不同性質(zhì)的碳源、氮源及無機(jī)鹽分別對本底培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整形成新的培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵試驗并檢測，同時采用正交實驗進(jìn)行比較。結(jié)果表明平菇液體培養(yǎng)，葡萄糖為最佳碳源，蔗糖與紅糖稍次，麥芽糖與乳糖表現(xiàn)最差；酵母浸出粉為最佳氮源，玉米粉最次；無機(jī)鹽表現(xiàn)出影響小，彼此間差異不明顯。單因素分析和正交實驗確定了酵母浸出粉、葡萄糖、MgSO4、K2HPO4的最佳用量。蛋白質(zhì)含量最高的培養(yǎng)基配方是酵母浸出粉2%、葡萄糖4%、MgSO40.15%、K2HPO40.05%。

平菇；菌種；液體培養(yǎng)；因素分析

自從Hunfeid[1]最早報道四孢蘑菇（Agaricus campesriss）的菌絲能夠進(jìn)行液體培養(yǎng)以來，有多種食（藥）用真菌菌絲液體發(fā)酵獲得了成功。當(dāng)前，國際上食用菌制種行業(yè)已走上產(chǎn)業(yè)化、專業(yè)化、工廠化大規(guī)模生產(chǎn)的道路，液體菌種具有培養(yǎng)時間短、發(fā)菌快、菌齡整齊、接種方便等優(yōu)點，且有利于食用菌規(guī)?；⒅苣昊?、工廠化生產(chǎn)，使其越來越受到食用菌生產(chǎn)企業(yè)的青睞，已成為食用菌制種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢[2]。平菇（Pleurotus ostreatus）是我國栽培最廣泛的食用菌之一，產(chǎn)量占全國食用菌總產(chǎn)量的40%左右[3]。平菇不僅具有很高的營養(yǎng)和醫(yī)療保健價值[4]，而且在生物修復(fù)和廢棄物生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域也有重要作用[5]。目前平菇栽培主要采用固體菌種，菌種生產(chǎn)周期較長且質(zhì)量不穩(wěn)定。平菇液體菌種發(fā)酵研究也有一些[6-7]，但還不深入。如何提高平菇液體菌種的質(zhì)量，需要搞清其影響因素，本研究采用不同營養(yǎng)源組合培養(yǎng)基進(jìn)行平菇液體發(fā)酵，并分析蛋白質(zhì)含量來判別菌絲體質(zhì)量，分析不同因子對菌絲體的影響，以便為將來大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)平菇液體菌種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料

平菇菌種黑平209來自阜陽師范學(xué)院微生物實驗室。母種斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，本底液體搖瓶菌種培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn) [8]，具體為葡萄糖4%、蛋白胨1%、NaCl 0.25%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%。培養(yǎng)基在微生物實驗室自制，馬鈴薯購自農(nóng)貿(mào)市場，其它化學(xué)試劑取自微生物實驗室藥品柜。HZQF160往復(fù)式恒溫振蕩器購自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司，TGL-16C型離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠，PHS-3B精密pH計購自上海精密科學(xué)儀器有限公司，LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋購自上海核子儀器廠，電熱恒溫水浴鍋均購自合肥科隆公司。FA2104電子天平、凱氏定氮儀、超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2方法

1.2.1 時間地點

2013年11月～2014年3月在阜陽師范學(xué)院微生物實驗室進(jìn)行試驗。

1.2.2 菌種準(zhǔn)備

從實驗室栽培平菇中選取生長健壯、株型特征明顯的子實體，在超凈工作臺運用組織分離法分離出菌柄菌蓋結(jié)合處的潔白菌肉，接種于已制好并滅菌的PDA斜面培養(yǎng)基上，放置在恒溫培養(yǎng)箱中，25℃避光培養(yǎng)至菌絲長滿斜面。

液體菌種的制作：將PDA斜面上的菌種接種到本底液體培養(yǎng)基中，500 mL搖瓶內(nèi)裝入120 mL本底培養(yǎng)液，高壓滅菌后冷至25℃左右，接入4塊0.5 cm2的等量斜面平菇菌塊，使氣生菌絲一面向上懸浮，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃靜置培養(yǎng)24 h。然后將搖瓶置于往復(fù)式恒溫振蕩器內(nèi)，25℃、121 r·min-1震蕩培養(yǎng)7 d[8-9]。

1.2.3 試驗設(shè)計

將本底搖瓶培養(yǎng)液配方中的碳源葡萄糖分別用蔗糖、紅糖、乳糖和麥芽糖以相應(yīng)濃度替換配制，連同本底共5種配方，500 mL搖瓶裝液量為120 mL培養(yǎng)液，每種設(shè)3次重復(fù)。高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌20 min，接種量為搖勻的菌絲分布一致的液體菌種10 mL。25℃、121 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。定量過濾，用雙蒸水洗滌3次，45℃烘干至恒重，稱重[10]。凱氏定氮法測定相應(yīng)培養(yǎng)基配方中菌絲體蛋白含量。與碳源替換配制類似，將酵母浸出粉、黃豆粉、蠶蛹粉和玉米粉作為氮源成分，分別代替本底配方中的蛋白胨，為增加效果顯著性，含量都按2%的濃度配制，培養(yǎng)檢測同上。

無機(jī)鹽的影響效果較難確定，因食用菌生長要求的無機(jī)鹽不止一種，為既能保證食用菌菌絲的生長，又能明顯地表現(xiàn)出相應(yīng)無機(jī)鹽影響的效果，特使原配方中無機(jī)鹽含量不變，再分別按照0.1%的含量標(biāo)準(zhǔn)加入KCl、KH2PO4、K2HPO4、NaCl和MgSO4·7H2O，配制成5種新的配方，按前法滅菌、接種、培養(yǎng)和檢測。

1.2.4 優(yōu)化培養(yǎng)基的篩選方法

根據(jù)檢測結(jié)果，選取效果最優(yōu)碳源、氮源、無機(jī)鹽設(shè)計四因子、三水平的L9（34） 正交試驗，選定平菇最適培養(yǎng)基組成，設(shè)3次重復(fù)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1不同碳源對菌絲蛋白質(zhì)含量的影響

不同碳源對菌絲蛋白質(zhì)含量的影響見圖1。

由圖1可見，使用不同性質(zhì)的糖作碳源培養(yǎng)的菌絲體蛋白質(zhì)含量有差異，相對優(yōu)劣的排列次序為：葡萄糖＞紅糖＞蔗糖＞乳糖＞麥芽糖?？梢娖焦竭m合以葡萄糖作為碳源，經(jīng)過方差分析，葡萄糖、紅糖和蔗糖培養(yǎng)基所測蛋白質(zhì)含量結(jié)果之間差異不明顯（P＞0.05），說明紅糖和蔗糖也較易為平菇吸收利用，只是稍次于葡萄糖。乳糖和麥芽糖類似，但與葡萄糖、紅糖、蔗糖差異顯著（P＜0.05），說明平菇利用乳糖或麥芽糖相對困難。所以，本試驗中葡萄糖為最佳碳源。

2.2不同氮源對培養(yǎng)菌絲體中蛋白質(zhì)含量的影響

不同氮源對培養(yǎng)菌絲體中蛋白質(zhì)含量的影響見圖2。

圖1 不同碳源培養(yǎng)菌絲體中蛋白質(zhì)含量Fig.1 Protein content of oyster mushroom’s hypha in liquid medium of different carbon sources level

圖2 不同氮源培養(yǎng)菌絲體中蛋白質(zhì)的含量Fig.2 Protein content of oyster mushroom’s hypha in liquid medium of different nitrogen sources level

圖2表明，不同性質(zhì)的氮源對平菇菌絲體蛋白質(zhì)含量影響較明顯，效果優(yōu)劣次序為酵母浸出粉＞蛋白胨＞黃豆粉＞蠶蛹粉＞玉米粉。酵母浸出粉、蛋白胨和黃豆粉之間差異不顯著（P＞0.05），所以這三種成分經(jīng)常用來作為平菇培養(yǎng)的氮源，這三種物質(zhì)與蠶蛹粉比較差異顯著（P＜0.05），與玉米粉比較差異極顯著（P＜0.01），蠶蛹粉與玉米粉間的差異也表現(xiàn)出顯著水平，這說明蠶蛹粉作為平菇培養(yǎng)的氮源效果并不好，玉米粉作為氮源也不適合，因其含大量淀粉，作為碳源使用可能更好，但應(yīng)以試驗為依據(jù)。本試驗中酵母浸出粉為最佳氮源。

2.3不同無機(jī)鹽含量變化對培養(yǎng)菌絲體蛋白質(zhì)含量的影響

不同無機(jī)鹽含量變化對培養(yǎng)菌絲體蛋白質(zhì)含量的影響見圖3。

圖3 不同無機(jī)鹽培養(yǎng)菌絲體中蛋白質(zhì)的含量Fig.3 Protein content of oyster mushroom’s hypha in liquid medium of different inorganic salt level

由圖3可見，在本底培養(yǎng)液中加入相同比例的不同無機(jī)鹽時，測定蛋白質(zhì)含量，優(yōu)劣次序排列為MgSO4＞K2HPO4＞KH2PO4＞KCl＞NaCl；經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)各無機(jī)鹽間差異不顯著，表明在本試驗中無機(jī)鹽對平菇菌絲體蛋白質(zhì)含量的影響小，這一點估計是與試驗設(shè)計有關(guān)，如何既能讓菌絲滿足生長時無機(jī)鹽供應(yīng)，又能表現(xiàn)出影響因子的效果，的確需要進(jìn)一步的方法研究。在略微差異的情況下，本試驗得出MgSO4和K2HPO4為最佳無機(jī)鹽。

2.4平菇液體培養(yǎng)基最佳配方的篩選

選取本實驗中最佳碳源葡萄糖，最佳氮源酵母浸出粉，最佳無機(jī)鹽MgSO4、K2HPO4為供試因子，設(shè)置正交實驗，見表1。

表1 正交實驗因素及水平Tab.1 The factor and level of orthogonal test

2.5平菇液體培養(yǎng)基最佳配方的確定

平菇液體培養(yǎng)基最佳配方的確定見表2。

由表2可以看出，A的極差極大，其次是B、C、D。即對蛋白質(zhì)含量影響最大的因子是酵母浸出粉，其次是葡萄糖、MgSO4、K2HPO4。為了進(jìn)一步考察各因子對指標(biāo)的影響，進(jìn)行了完全隨機(jī)模型方差分析，見表3。在99%置信度下，A對指標(biāo)的影響是顯著的（P＜0.05）。由表2可得所測蛋白質(zhì)含量最高的培養(yǎng)基配比是A2B2C3D1，即酵母浸出粉2%、葡糖糖4%、MgSO40.15%、K2HPO40.05%。

3 討論

平菇屬于木腐菌，分解有機(jī)質(zhì)的能力較強(qiáng)，自然界適于其生長的秸稈及木質(zhì)材料較為廣泛。該試驗表明，不同碳源、氮源對平菇生長的質(zhì)量有明顯影響。這就提醒了某種食用菌在某種有機(jī)質(zhì)中能夠生長，并不能說明這種有機(jī)質(zhì)就非常適合其生長，反過來說，要發(fā)揮食用菌的最佳生長能力，還必須非常清楚地了解其最佳生長要求，只有選擇對其生長最有利的碳源、氮源，才能實現(xiàn)最佳生長。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果Tab.2 The results of L9(34)orthogonal test

表3 正交設(shè)計方差分析表（完全隨機(jī)型）Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment(total random model)

菌絲的發(fā)酵生長具有典型的邏輯斯蒂（Logistic）規(guī)律[3]。在本試驗初期搖瓶培養(yǎng)中，菌絲生長比較緩慢，培養(yǎng)3 d～5 d菌絲球增長旺盛，6 d～7 d菌絲球數(shù)量達(dá)到頂峰。隨著培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分的減少，菌絲活性開始減弱，生長速度開始下降。秦俊哲等[12]的研究表明，食用菌菌絲液體發(fā)酵7 d后，菌絲球的自溶開始加快，培養(yǎng)液變的渾濁。所以，本試驗的數(shù)據(jù)檢測都是在培養(yǎng)至第7天進(jìn)行。

無機(jī)鹽是食用菌生長發(fā)育過程中必需物質(zhì)，但在本試驗中，添加不同無機(jī)鹽的效果相比較差異不明顯，分析原因，可能是無機(jī)鹽屬微量調(diào)節(jié)因子，食用菌對無機(jī)鹽的需要量少，加之不同無機(jī)鹽的添加是在本底培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，原培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽并不缺乏，碳源和氮源中也可能含有一定量的無機(jī)鹽。可見試驗中的不明顯差異只可能是不同無機(jī)鹽濃度變化造成的，在一定程度上反映了它們的影響效果。在最佳配方的篩選中，只利用了影響效果最明顯的2個無機(jī)鹽，這在滿足食用菌全面生理需求上是有缺陷的，有研究表明[13]，鈉鹽和鈣鹽也是食用菌生長必不可少的，可見，即使試驗中影響效果小也不應(yīng)該缺乏，至于最佳添加量，還有待試驗研究。鑒于各因素間還存在相互制約，碳源和氮源的比例也會發(fā)生變化。本試驗的最佳配方只有一定的參考意義。

食用菌的液態(tài)深層培養(yǎng)可以實現(xiàn)菌絲體的快速生產(chǎn)，通過優(yōu)化生產(chǎn)條件，可以提高其生物活性物質(zhì)的含量[14]。本試驗表明，平菇液體發(fā)酵的優(yōu)化，不僅可快速生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)平菇菌種，還可以為人們提供大量液態(tài)發(fā)酵的平菇蛋白質(zhì)，有利于改善人們的膳食結(jié)構(gòu)。

[1]Humfeld H.The production of mushroom mycelium(Agaricus campestris) in submerged culture[J].Science,1948,107 (2780):373.

[2]戴建清，曾志恒.食用菌液體菌種研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].中國食用菌，2012，31（5）：1-3.

[3]王蘭青，高玉千，戚元成，等.平菇液體菌種搖瓶和發(fā)酵罐生長動力學(xué)模型的比較[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2010，29（6）：927-930.

[4]Gern RM,Wisbeck E,Rampinelli.Alternative medium for production of Pleurotus osteratus biomass and potential antitumor polysaccharided[J].Bioresource Technology,2008,99 (1):76-82.

[5]Rodrguez Prez S,Garca Oduardo N,Bermdez Sarn RC.Decolourisation of mushroom farm wastewater by Pleurotus osteratus[J].Biodegradation,2008,19(4):519-526.

[6]陳聿美，陳俊標(biāo)，焦瑞身.蘑菇菌的深層培養(yǎng)[J].實驗生物學(xué)報，1963（8）：548-557.

[7]卜慶梅，王淑芳，王瑜，等.四種平菇菌種液體培養(yǎng)選育研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（3）：458-459.

[8]孟麗君，王芳，張玉萍，等.平菇液體菌種的制備條件及應(yīng)用研究[J].中國食用菌，2007，26（5）：48-50.

[9]王淑芳，卜慶梅，鐘旭生，等.平菇液體菌種發(fā)酵料栽培研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（3）：106-108.

[10]張志軍，羅瑩，李淑芳，等.液體菌種培養(yǎng)時間對靈芝液體發(fā)酵的影響[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2008，3（4）：289-292.

[11]陳今朝,戴玄,譚永忠,等.平菇液體種子培養(yǎng)基優(yōu)化[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008，30（5）：915-918.

[12]秦俊哲，魏穎杰，陳合，等.金針菇液體菌種培養(yǎng)過程檢測指標(biāo)的研究[J].食用菌學(xué)報，2003，10（1）：12-16.

[13]刁治民，劉禹宏，田玉華.青海藥用蕈菌[M].西寧：青海人民出版社，1994.

[14]Wang Zhaolong,Wang Xiaoxia,Chen Weiying.Inhibitory effect of Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris on human glemerularmes angial cell proliferation induced by native LDL[J].Cell Biochemical Fungus,2000,18(2):93-97.

Analysis of Influencing Factors on the Quality of Oyster Mushroom’s Hypha in Liquid Culture Medium

FAN Ke-zhang1,CHEN Ling2,ZHANG Zhen2,CAI Jian1
(1.School of Life Science,Fuyang Teachers College,Fuyang 236041,China; 2.Advanced Professional High School of Ninglaozhuang,Fuyang 236036,China)

In order to know the factors which was more implications in the oyster mushroom’s liquid culture medium,and conveient for confirming key concern factors in practice,the test was carryed on especially.Using the black oyster mushroom 209 as the test material,the quality of mushroom growth by measuring the dry weight and the protein content of its hypha per unit were determined.Diffient properties of carbon source,nitrogen source and mineral salt were used to adjust the relevant material in the background medium and to form the new mediums.The fermentation test were carried on to measure the informations.On the same time,the orthogonal test was done to compare the diverse.In oyster mushroom’s liquid culture medium,glucose was the best carbon source,followed by sucrose and brown sugar,and maltose and lactose were the worst in this test.Powder of yeast extracts was the best nitrogen source,and corn flour was the worst.Mineral salts had no obvious difference between each other.The best use level of yeast extracts,glucose,magnesium sulfate and dipotassium phosphate were determined by single factor analysis and orthogonal test.The formula of the culture medium which can produce the most protein content was powder of yeast extracts 2%,glucose 4%,magnesium sulfate 0.15%,dipotassium phosphate 0.05%.

oyster mushroom;strain;liquid culture medium;factor analysis

A

1003-8310（2015）04-0021-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.04.005

安徽省教育廳自然科學(xué)項目（KJ2013B197）；安徽省高校自然科學(xué)基金重點項目（KJ2014A194）。

范可章（1970-），男，碩士，講師，主要從事食用菌栽培的教學(xué)與研究工作。E-mail:fankezhang@126.com

**通信作者：蔡健 (1965-)，男，博士，教授，主要從事植物生物技術(shù)研究工作。E-mail:fycaijian@163.com

2015-05-02