史自濤 姚焰礎(chǔ) 江 山 肖 融 劉作華楊飛云 董國(guó)忠 郭致君

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，榮昌 402460;2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北碚 400715;3.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100081)

斷奶可造成仔豬心理、飼糧、環(huán)境等應(yīng)激，極 易引起斷奶應(yīng)激綜合征，導(dǎo)致仔豬腸道菌群失調(diào)、采食量下降、生長(zhǎng)緩慢、腹瀉甚至死亡，經(jīng)濟(jì)損失因而較大。因此，確保仔豬順利斷奶對(duì)提高養(yǎng)豬效益具有重要的意義?？股鼐哂酗@著的抗病、抗應(yīng)激和促生長(zhǎng)效果，在斷奶仔豬以及生長(zhǎng)育肥豬飼養(yǎng)過(guò)程中被廣泛應(yīng)用［1］。但是，抗生素殘留、細(xì)菌耐藥性增加、長(zhǎng)期使用導(dǎo)致畜禽免疫力降低以及引起畜禽二次感染等問(wèn)題，也引起了人們極大的關(guān)注［2］，因此，尋找抗生素替代品便成為現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。益生菌是可以通過(guò)改善腸道微生態(tài)區(qū)系而對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生有益影響的活的微生物添加劑［3］，有研究表明，益生菌是一種理想的抗生素替代品［4］。糞腸球菌是乳酸菌的一種，是存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的一種兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌，農(nóng)業(yè)部在2008年公布的第1126號(hào)公告顯示，我國(guó)允許在飼料中添加的益生菌種類達(dá)到16種，其中包括糞腸球菌。近年來(lái)，糞腸球菌在斷奶仔豬飼糧中的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道，其添加量及效果也不盡相同，且其能否替代抗生素應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧的研究也未見(jiàn)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)通過(guò)在斷奶仔豬飼糧中添加不同水平的糞腸球菌，研究其替代抗生素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉指數(shù)及腹瀉率、血液生化指標(biāo)及免疫器官的影響，為糞腸球菌在斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糞腸球菌:糞腸球菌凍干菌粉(1.0×1010CFU/g)，由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

抗生素:硫酸黏菌素和桿菌肽鋅購(gòu)自江蘇天成保健品有限公司，其純度均為10%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

選用(28±2)日齡平均體重為(7.60±0.81)kg的“杜×長(zhǎng)×大”斷奶仔豬120頭，隨機(jī)分為5個(gè)組，每個(gè)組6個(gè)重復(fù)(公母各占1/2)，每重復(fù)4頭，每個(gè)重復(fù)為1圈。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加100 mg/kg硫酸黏菌素和400 mg/kg桿菌肽鋅，3個(gè)糞腸球菌組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加40、200和1 000 mg/kg糞腸球菌(飼糧中實(shí)際所含的糞腸球菌水平分別為4×105、2×106、1×107CFU/g)。基礎(chǔ)飼糧參照 NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutritent levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)在重慶市畜牧科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)豬場(chǎng)進(jìn)行，所有仔豬在封閉式豬舍中飼養(yǎng)，水泥地面，自由采食和飲水，驅(qū)蟲(chóng)、消毒及免疫均按豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行，試驗(yàn)期31 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)全程以圈為單位記錄采食量，第1、15和32天08:00對(duì)每頭仔豬空腹稱重，計(jì)算1～14 d、15～31 d及1～31 d的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)及料重比(F/G)。

1.4.2 腹瀉指數(shù)及腹瀉率

試驗(yàn)期內(nèi)每天09:00和15:00分別觀察仔豬糞便，按照 Marquardt等［5］的方法對(duì)糞便進(jìn)行評(píng)分。0分:糞便條形或粒狀;1分:軟糞、能成形;2分:稠裝、不成形、糞水未分離;3分:液狀、不成形、糞水分離。當(dāng)糞便評(píng)分為2或以上時(shí)認(rèn)為仔豬發(fā)生腹瀉。計(jì)算1～14 d、15～31 d及1～31 d的腹瀉指數(shù)和腹瀉率。

1.4.3 血液生化指標(biāo)

在試驗(yàn)期第32天08:00，每個(gè)組每個(gè)重復(fù)選1頭接近平均體重的仔豬，空腹前腔靜脈采血5 mL于抗凝管中，采用CX4 Pro全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter公司，美國(guó))測(cè)定血液中葡萄糖、總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、總膽固醇和尿素氮含量以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活性。計(jì)算白蛋白/球蛋白(A/G，簡(jiǎn)稱白球比)。

1.4.4 免疫器官的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)組每個(gè)重復(fù)選1頭接近平均體重的仔豬屠宰，切開(kāi)腹腔取肝臟和脾臟，去除結(jié)締組織稱取濕重，并計(jì)算其器官指數(shù)。

器官指數(shù)(g/kg)=器官濕重/活體重。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

先用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，再通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以 P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，在1～14 d，飼糧中添加抗生素和糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬的ADFI和ADG無(wú)顯著影響(P＞0.05)。在15～31 d，與對(duì)照組和抗生素組相比，200和1 000 mg/kg組均可極顯著提高ADFI和 ADG(P＜0.01)。在 1 ～31 d，與對(duì)照組相比，200和1 000 mg/kg組的ADFI均極顯著提高(P＜0.01)，而ADG分別顯著和極顯著增加(P＜0.05 和 P＜0.01);與抗生素組相比，1 000 mg/kg組可極顯著提高 ADFI(P＜0.01)，200和 1 000 mg/kg組的ADG分別顯著和極顯著增加(P＜0.05 和 P＜0.01)。

2.2 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響

由表3可知，在1～14 d，與對(duì)照組相比，40 mg/kg組可以顯著降低斷奶仔豬的腹瀉指數(shù)和腹瀉率(P＜0.05)。在 15～31 d和 1～31 d，飼糧中添加抗生素和糞腸球菌對(duì)腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響差異不顯著(P＞0.05)，但40和1 000 mg/kg組均可以在一定程度上降低15～31 d及1～31 d的腹瀉率，其中15～31 d腹瀉率分別比對(duì)照組降低了29.85%和33.92%，1～31 d腹瀉率分別比對(duì)照組降低了47.50%和28.80%。

2.3 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加抗生素對(duì)斷奶仔豬血液中總蛋白和球蛋白含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，而糞腸球菌可以顯著提高血液中總蛋白含量(P＜0.05)，其中添加量為 200和1 000 mg/kg時(shí)達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，且這2組分別可以顯著和極顯著提高血液中球蛋白含量(P＜0.05 和 P＜0.01);與抗生素組相比，200 和1 000 mg/kg組的總蛋白含量也均顯著提高(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，抗生素組和1 000 mg/kg組白球比顯著降低(P＜0.05)，而抗生素組血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低(P＜0.05)，200 mg/kg組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低(P＜0.05)，糞腸球菌對(duì)谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無(wú)顯著影響(P＞0.05)。抗生素和糞腸球菌對(duì)血液中尿素氮、甘油三酯、葡萄糖含量以及乳酸脫氫酶活性影響均不顯著(P＞0.05)。

2.4 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬免疫器官的影響

由表5可知，飼糧中添加抗生素和糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬脾臟重量和肝臟指數(shù)無(wú)顯著影響(P＞0.05)，1 000 mg/kg組肝臟重量和脾臟指數(shù)可一定程度上提高(P＞0.05)，分別比對(duì)照組提高10.92%和 19.70%。與抗生素組相比，200和1 000 mg/kg組可顯著提高肝臟重量(P＜0.05)。

表2 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of Enterococcus faecalis on growth performance of weaner piglets

表3 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響Table 3 Effects of Enterococcus faecalis on diarrhea index and diarrhea rate of weaner piglets

3 討論

3.1 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

腸道中的益生菌可以與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生有機(jī)酸及抑菌成分，抑制病原菌的生長(zhǎng)，優(yōu)化腸道微生態(tài)區(qū)系，改善腸道健康，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，從而達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的［6-7］。糞腸球菌是益生菌的一種，侯璐［8］的研究表明，糞腸球菌具有耐酸、耐膽鹽以及耐高溫等特性，能夠順利到達(dá)畜禽腸道并存活，Hugas等［9］指出，糞腸球菌可產(chǎn)生有機(jī)酸及細(xì)菌素，抑制腸道內(nèi)病原菌及腐敗微生物的生長(zhǎng)，降低盲腸及回腸pH，從而優(yōu)化腸道環(huán)境。

表4 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of Enterococcus faecalis on blood biochemical parameters of weaner piglets

表5 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬免疫器官的影響Table 5 Effects of Enterococcus faecalis on immune organs of weaner piglets

目前，關(guān)于糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能影響的報(bào)道效果不一。劉輝等［10］在斷奶仔豬飼糧中添加糞腸球菌發(fā)現(xiàn)，ADG提高了8.79%，F(xiàn)/G降低了8.43%，差異顯著。侯璐［8］在斷奶仔豬飼糧中添加糞腸球菌發(fā)現(xiàn)，ADG提高了8.51%，F(xiàn)/G降低了7.57%，但差異不顯著。而Ross等［11］在斷奶仔豬飼糧中添加糞腸球菌之后，仔豬采食量會(huì)顯著降低而飼料利用率顯著提高。本試驗(yàn)1～14 d，糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能影響不顯著。Estienne等［12］指出，斷奶后2周是仔豬適應(yīng)斷奶的關(guān)鍵時(shí)期，也是仔豬腸道微生態(tài)區(qū)系最脆弱的時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期使用乳酸菌其效果最好。本試驗(yàn)1～14 d結(jié)果與上述結(jié)論不符，表明糞腸球菌添加量為1 000 mg/kg時(shí)還不足以體現(xiàn)出其益生作用，提示仔豬在斷奶后2周對(duì)糞腸球菌的需要量可能更大。在15～31 d，飼糧中糞腸球菌添加量為40 mg/kg(飼糧中實(shí)際所含糞腸球菌水平為4×105CFU/g)時(shí)對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能影響不顯著，而添加量為200和1 000 mg/kg(飼糧中實(shí)際所含糞腸球菌水平分別為2×106和1×107CFU/g)時(shí)，ADFI和ADG均極顯著提高，且后者效果優(yōu)于前者。Gardiner等［13］指出，飼糧中益生菌的最低添加量應(yīng)達(dá)到 1×106CFU/g，并且 Guerra等［14］進(jìn)一步指出，在一定的添加范圍內(nèi)，生長(zhǎng)性能會(huì)隨著益生菌添加量的提高而進(jìn)一步改善，本試驗(yàn)15～31 d的結(jié)果與上述結(jié)論一致。

3.2 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率的影響

在斷奶過(guò)程中，仔豬受到心理、飼糧以及環(huán)境等應(yīng)激時(shí)極易引起腸道微生態(tài)區(qū)系紊亂，導(dǎo)致有害菌大量繁殖，從而引起腹瀉的發(fā)生。Fairbrother等［15］指出，斷奶后腸道中大量增殖的大腸桿菌是引起腹瀉的主要病原菌，Sandine［16］也指出，腹瀉動(dòng)物糞便中大腸桿菌數(shù)量要明顯高于乳酸桿菌。有研究表明，益生菌可以增殖有益菌，抑制有害菌的繁殖，從而降低腹瀉的發(fā)生。Larsen等［17］在斷奶仔豬飼糧中添加芽孢桿菌后，仔豬腹瀉率顯著降低，他還指出，仔豬回腸和糞便中大腸桿菌數(shù)量顯著降低、回腸中乳酸菌數(shù)量顯著升高，芽孢桿菌對(duì)腸道微生態(tài)環(huán)境的改善是腹瀉率降低的主要原因。同樣，Mallo等［18］在斷奶仔豬飼糧中添加屎腸球菌的研究也得到相似的結(jié)論。本試驗(yàn)1～14 d，糞腸球菌40 mg/kg組可以顯著降低腹瀉指數(shù)和腹瀉率，在15～31 d及1～31 d，糞腸球菌40和1 000 mg/kg組均可以在一定程度上降低腹瀉率。糞腸球菌可以產(chǎn)生有機(jī)酸和細(xì)菌素，抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)［9］，劉輝等［10］和侯璐［8］均指出，糞腸球菌可顯著降低斷奶仔豬糞便中大腸桿菌數(shù)量，顯著增加糞便中乳酸菌數(shù)量，因此，本研究中糞腸球菌對(duì)腹瀉的改善作用可能與其對(duì)大腸桿菌的抑制有關(guān)，其具體原因需進(jìn)一步探究。另外，辛娜等［19］指出，當(dāng)過(guò)量外源微生物進(jìn)入腸道后，會(huì)與腸道內(nèi)正常菌群爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)合位點(diǎn)，在一定程度上擾亂腸道內(nèi)正常微生態(tài)區(qū)系的穩(wěn)定，這可能是本試驗(yàn)中糞腸球菌添加量為200和1 000 mg/kg時(shí)對(duì)腹瀉的改善效果不如40 mg/kg顯著的原因。在試驗(yàn)的1～14 d、15～31 d和1～31 d，糞腸球菌40和1 000 mg/kg組對(duì)仔豬腹瀉的抑制作用均優(yōu)于抗生素組，因此，糞腸球菌可以替代抗生素用來(lái)預(yù)防仔豬腹瀉。

3.3 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

血液是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境重要的組成部分，血液中生理生化指標(biāo)的改變可反映動(dòng)物機(jī)體或器官的代謝和健康狀況?？偟鞍子砂椎鞍缀颓虻鞍捉M成，血液中其含量可反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝狀況。白蛋白由肝臟合成，是機(jī)體蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，而球蛋白由B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞后分泌產(chǎn)生，血液中抗體水平增加時(shí)球蛋白含量也會(huì)隨之增加，其可反映機(jī)體的免疫水平。白球比可反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，白球比降低表明球蛋白的合成增加，說(shuō)明機(jī)體免疫機(jī)能提高［20-21］。本試驗(yàn)中，糞腸球菌可顯著(40 mg/kg組)或極顯著(200和1 000 mg/kg組)提高血液中總蛋白含量，糞腸球菌200和1 000 mg/kg組的球蛋白含量也分別顯著和極顯著增加，1 000 mg/kg組的白球比顯著降低，而抗生素對(duì)總蛋白、白蛋白、球蛋白含量以及白球比影響均不顯著，這表明糞腸球菌可替代抗生素，改善仔豬機(jī)體蛋白質(zhì)代謝，提高仔豬免疫力。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要分布于動(dòng)物肝細(xì)胞及其他組織細(xì)胞內(nèi)，正常情況下這2種酶在血液中活性很低，但是當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，這2種酶會(huì)進(jìn)入血液中，因此，血液中這2種酶活性可反映肝臟功能狀況［22］。本試驗(yàn)中，抗生素可顯著降低血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，而糞腸球菌200 mg/kg組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低，表明糞腸球菌對(duì)仔豬肝臟功能具有一定的保護(hù)作用。

乳酸脫氫酶存在于機(jī)體各組織器官中，是參與糖酵解的一種重要的酶，與血液葡萄糖含量一樣，血液中乳酸脫氫酶活性可反映機(jī)體糖代謝狀況。血液中尿素氮含量可反映機(jī)體氨基酸平衡狀況，血液甘油三酯和總膽固醇含量是檢測(cè)體脂代謝狀況的重要指標(biāo)［23-24］。本試驗(yàn)中，抗生素和糞腸球菌對(duì)血液中這幾個(gè)指標(biāo)影響均不顯著，表明糞腸球菌對(duì)機(jī)體糖代謝、氨基酸平衡以及脂肪代謝均無(wú)負(fù)面影響。

3.4 糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬免疫器官的影響

肝臟是動(dòng)物體內(nèi)新陳代謝最旺盛的代謝器官，還擔(dān)負(fù)著一定的免疫功能。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，是各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分化、成熟、定居以及進(jìn)行免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所［25］。器官指數(shù)是試驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)指標(biāo)之一，其大小可在一定程度上反映機(jī)體器官功能的強(qiáng)弱［26］。關(guān)于益生菌對(duì)斷奶仔豬免疫器官影響的報(bào)道很多，但效果各異。王永等［27］在斷奶仔豬飼糧中添加屎腸球菌發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌對(duì)肝臟指數(shù)影響不顯著，但可顯著提高脾臟重量和脾臟指數(shù)，從而促進(jìn)脾臟的發(fā)育。辛娜等［28］指出，芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬的肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)以及脾臟指數(shù)影響不顯著，但具有增大免疫器官指數(shù)的趨勢(shì)，而周盟等［29］則指出，斷奶仔豬免疫器官的發(fā)育不受益生菌的影響。上述研究結(jié)果的不同可能與試驗(yàn)動(dòng)物品種、菌種、加工貯存條件、添加劑量以及試驗(yàn)環(huán)境等有關(guān)。到目前為止，還沒(méi)有關(guān)于糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬免疫器官影響的報(bào)道。本試驗(yàn)中，1 000 mg/kg組肝臟重量和脾臟指數(shù)可一定程度的提高;與抗生素組相比，200和1 000 mg/kg組均可顯著提高肝臟重量，表明糞腸球菌可以在一定程度上促進(jìn)斷奶仔豬肝臟和脾臟的發(fā)育，改善其免疫功能。分析其原因，可能是由于糞腸球菌自身作為一種抗原物質(zhì)，可以有效的刺激肝臟和脾臟的生長(zhǎng)發(fā)育，另外，糞腸球菌在斷奶仔豬腸道中生長(zhǎng)繁殖，合成的一些有益成分可能也會(huì)對(duì)肝臟和脾臟的發(fā)育產(chǎn)生一定的刺激作用，其具體原因有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

①飼糧中添加糞腸球菌可提高15～31 d的ADFI和ADG，改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能。另外，糞腸球菌可降低仔豬腹瀉率，且效果優(yōu)于抗生素。

②飼糧中添加糞腸球菌可提高血液中總蛋白和球蛋白含量，降低白球比以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，對(duì)肝臟和脾臟發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用，可以改善仔豬機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和免疫功能，緩解斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬的負(fù)面影響。

③綜合本試驗(yàn)結(jié)果，糞腸球菌可替代抗生素而應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧中，且添加量為1 000 mg/kg時(shí)的效果最好。

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