曹曉燕 汪珊如 徐 雯 徐高蹺 張勝男 王士長 梁世忠*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005;2.南寧學(xué)院，南寧 530200)

近年來，一些學(xué)者對厭氧和兼性厭氧的纖維素降解菌進行了研究［1－3］，以擴大纖維素酶的應(yīng)用。但對于腸道中厭氧型降解菌的研究鮮有報道，而動物腸道中99%的菌群是厭氧或者是兼性厭氧菌［4］。竹鼠，分類地位是哺乳綱嚙齒目竹鼠科竹鼠屬和小竹鼠屬，主要分布在我國的南部和中部地區(qū)、緬甸北部和越南等國家和地區(qū)。竹鼠屬于草食性動物，日常主要以植物的根莖類為食。平時飼養(yǎng)時主要以農(nóng)作物的新鮮秸稈為飼料，其采食的部分是其他動物棄食的部分，是消化利用粗纖維的佼佼者。中華竹鼠主要以成熟竹子為食物來源，對于纖維素具有很強的消化能力。本試驗的目的是從竹鼠腸道中分離、鑒定出高活力厭氧纖維素降解菌，以期為提高動物腸道纖維素的利用率，增加動物抵抗力，減少抗生素的使用和解決厭氧環(huán)境下高效分解纖維素利用率提供理論支持，為綠色粗詞料微生物添加劑的研究和開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1.1.1.1 初篩培養(yǎng)基［5－6］

礦物質(zhì)溶液:(NH4)2SO46.0 g，NaCl 6.0 g，MgSO40.6 g，CaCl20.6 g，加蒸餾水至 1 000 mL。

培養(yǎng)基:NH4Cl 2.0 g，K2HPO41.8 g，酵母膏1.2 g，礦物質(zhì)鹽溶液 150 mL，DL－半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，纖維素［微晶纖維素(MCC)或羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)］懸濁液100 mL(5%，m/V)，pH調(diào)至7.0，加蒸餾水至1 000 mL。滅菌后，按照每200 mL培養(yǎng)基加入1 mL剛果紅(CR)溶液(10 mg/mL)的比例加入CR溶液，混勻后倒入平板。

1.1.1.2 復(fù)篩培養(yǎng)基［5］

復(fù)篩培養(yǎng)基組成中纖維素懸濁液采用纖維二糖代替作為唯一的碳源，溶液纖維二糖含量5%(m/V)，其他成分同初篩培養(yǎng)基。

1.1.2 樣品采集

選取3只5月齡雄性的竹鼠，體重約1.5 kg作為試驗對象(購自廣西省南寧市金誠雙豐經(jīng)濟動物養(yǎng)殖科技有限公司)，其飼糧由粗飼料和精飼料組成。粗飼料由米糠、新鮮竹子、黃竹草下端莖部、玉米粒組成。精飼料由米飯、預(yù)混料(212AA，廣西彼得漢預(yù)混飼料有限公司)和配合飼料(采用膨化乳豬配合料，購自廣西金蘋果飼料有限公司)組成。上午飼喂2次，在09:00左右將米飯(50%)、米糠(40%)、預(yù)混料(5%)、配合飼料(5%，用水泡濕)混合攪拌后進行飼喂，平均每只成年竹鼠總量為50 g左右;11:00左右飼喂新鮮竹子，每只竹鼠約21.00 g。下午飼喂 2次，在15:00左右飼喂新鮮黃竹草下端莖部，每只竹鼠約20 g;16:00左右飼喂泡好并晾干的玉米粒，每只竹鼠約15粒。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的篩選

在厭氧條件下，取竹鼠盲腸部分內(nèi)容物進行稀釋，選用初篩培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將倒好的平板置于37℃厭氧箱中進行培養(yǎng)，約72 h，同時設(shè)空白對照組(蒸餾水代替內(nèi)容物稀釋液)。待平板中有菌落長出，選取有透明水解圈(產(chǎn)生纖維素菌落的周圍將會出現(xiàn)明顯的透明水解圈)的單菌落鏡檢觀察是否為單一菌種，若是單一菌種，留存以備復(fù)篩，若不是單一菌種，繼續(xù)進行初篩分離純化。將初篩得到的幾株能產(chǎn)透明的水解圈的菌株在復(fù)篩培養(yǎng)基上進行單菌落培養(yǎng)(同時設(shè)空白對照組，蒸餾水代替菌液)，對比水解圈的大小和透明度，選出水解圈較大且透明度較好的2株菌。復(fù)篩培養(yǎng)條件同初篩。

1.2.2 纖維素酶活力測定

吸取 450μL 1%CMC-Na溶液(m/V)于2 mL離心管中，置于40℃的水浴鍋中預(yù)熱5 min。加入50μL的菌液并以滅活的菌液作為對照組，在水浴鍋中保溫反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，立即加入1 mL的二硝基水楊酸(DNS)試劑，煮沸反應(yīng)顯色5 min，冷卻至室溫。在540 nm下測其吸光度(OD)值。

纖維素酶活力定義:1 mL菌液于40℃ pH 4.8條件下，每分鐘水解1%CMC-Na溶液產(chǎn)生1μmol還原糖(以葡萄糖計，含量通過DNS試劑法測定［7］)的酶量，定義為1個活力單位。

1.2.3 菌種的16S rDNA序列測定

1.2.3.1 提取所篩選菌株的基因組DNA

用試劑盒對37℃培養(yǎng)48 h的菌株進行基因組DNA提取，細菌基因組DNA快速抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司。步驟如下:1)取1 mL過夜培養(yǎng)的細菌菌液，加入1.5 mL離心管中，用低溫冷凍離心機(H1850R，湘儀離心機儀器有限公司)室溫5 717×g離心1 min，棄上清，收集菌體，加入400μL裂解液(buffer digestion)，震蕩混勻。65℃水浴1 h至細胞完全裂解。水浴過程中，每10 min顛倒混勻1次，至混合液變澄清透明為裂解完全。為得到無RNA的DNA，在水浴后加入20μL RNase A(20 mg/mL)，室溫放置2～5 min。2)加入200 mL Buffer PB，充分顛倒混勻，－20℃冰箱放置5 min。3)室溫8 933×g離心5 min，將上清液(500～550μL)轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中。4)加入等體積的異丙醇，顛倒5～8次使之充分混勻，室溫放置2～3 min。室溫8 933×g離心5 min，棄上清。5)加入1 mL 75%乙醇，顛倒漂洗 1 ～3 min，8 933×g離心 2 min，棄上清。漂洗時一定要使沉淀懸浮起來。6)重復(fù)步驟5)1次。7)開蓋室溫，放入真空抽干機，至殘留的乙醇完全揮發(fā)。(注:此步絕不可省略，否則殘留的乙醇會嚴(yán)重影響得率和后續(xù)試驗。如果殘留的乙醇有掛壁現(xiàn)象，倒掉液體后再短暫離心，將殘留用移液器吸出。然后開蓋室溫放真空抽干機，至殘留的乙醇完全揮發(fā)。)8)得到的DNA用50～100μL TE緩沖液溶解。提取的總DNA可立即進行下一步試驗或－20℃保存。TE緩沖液組成為10 mmol/L Tirs-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0。9)提取的總 DNA 用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3.2 16S rDNA 的擴增、克隆與序列分析

將提取得到的DNA用作PCR擴增的模板，用細菌通用引物27F和1492R對16S rDNA序列進行擴增［8］。引物序列上游為 27F:5'－AGAGTTTGATCMTGGCTGAG －3'，下 游 為 1492R:5'－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3'。PCR 擴增反應(yīng)體系終體積為50μL。PCR擴增反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃ 3 min;變性94℃ 1 min，退火55℃40 s，延伸 72 ℃ 1.5 min，20個循環(huán);延伸 72 ℃10 min;4℃保溫。

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度約為1 500 bp。

對目的片段進行膠回收，得到單一的16S rDNA片段。電泳檢測16S rDNA片段濃度后，確定連接酶系。過夜培養(yǎng)后得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中。利用藍白斑篩選正確的轉(zhuǎn)化子。37℃搖床培養(yǎng)后，提取DNA并進行PCR擴增、電泳檢測，驗證正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

2.1.1 初篩結(jié)果

由圖1可見，初篩采用CMC-Na和MCC為纖維素源均有明顯的水解圈產(chǎn)生。在2種不同培養(yǎng)基上，各獲得3株水解圈較大且明顯的單菌落。

圖1 CMC-Na和MCC對纖維素降解菌的初篩培養(yǎng)Fig.1 Cellulolytic bacteria preliminary screening culture by CMC-Na and MCC

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果

由圖2可見，通過產(chǎn)水解圈大小和透明度的初步觀察，分別篩選出2株產(chǎn)水解圈相對較好的單菌落，分別命名為MCC菌株和CMC-Na菌株。它們都能在以纖維素二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。

圖2 2株產(chǎn)水解圈的單菌落Fig.2 Two strains of single colonies producing hydrolysis circle

2.2 纖維素酶活力

由表1可見，MCC菌株和CMC-Na菌株的纖維素酶活力分別為6.599和5.268 U/mL。

表1 2株纖維素降解菌的纖維素酶活力Table 1 Cellulolytic enzyme activity of two strains of cellulolytic bacteria U/mL

2.3 電泳圖結(jié)果分析

由圖3－A可見，總DNA成功提取。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3－B)，約為1 500 bp，與預(yù)期長度一致。驗證正確的轉(zhuǎn)化子(圖4)提取質(zhì)粒后生工生物工程(上海)有限公司進行測序(圖5和圖6)。

測序結(jié)果整理后，登陸NCBI，在GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast對測序所得到的序列進行同源性比對分析，記錄同源性最高菌株的GenBank登錄號。經(jīng)過軟件NTIVector比對，CMC-Na菌株和MCC菌株的一致性為99.4%。它們都與酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)具有很高的同源性，皆為99%。所得序列經(jīng)ClustalX 1.81軟件校正對齊后運用MEGA 4.1軟件的相鄰計算法［9］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖7和圖8，從中可以看出，MCC菌株、CMC-Na菌株和酪酸梭狀芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近。結(jié)果證明MCC菌株和CMC-Na菌株都屬于梭菌屬(Clostridium)。

圖3 提取的總DNA(A)和16S r DNA的PCR產(chǎn)物(B)Fig.3 Extracted total DNA(A)and PCR product of 16SrDNA(B)

3 討論

有研究報道，目前已經(jīng)篩選到的中溫厭氧纖維素降解細菌主要出現(xiàn)在6個屬中:梭菌屬(如C.papyrosolves［11］、C.cellulolyticum［12］)、擬 桿 菌 屬(Bacteroides，如 B.cellulo.solvens)、醋弧菌屬(Acetivibrio，如 A.cellulolyticus)、運動桿菌屬(Eubacterium，如E.cellulosolvens)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus，如 R.albus)、鹽胞菌屬(Halocella，如 H.cellulolytica)［10］。

圖4 轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR product of the transformant

圖5 MCC菌株的序列Fig.5 Sequence of MCC strain

圖6 CMC-Na菌株的序列Fig.6 Sequence of CMC-Na strain

圖7 MCC菌株16Sr DNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 16S rDNA phylogenetic tree of MCC strain

圖8 CMC-Na菌株16Sr DNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 16S rDNA phylogenetic tree of CMC-Na strain

酪酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)，即丁酸梭菌，屬于梭菌屬，革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌?？蓮挠谌撕蛣游锬c道、干酪和自然酸奶、土壤獲得。酪酸梭菌在動物體內(nèi)定植生長，能產(chǎn)生多種酶。其產(chǎn)生的β－淀粉酶、α－淀粉酶、脂酶、蛋白酶、半纖維素酶、纖維素酶等，可促進動物對多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、半纖維素、纖維素等消化吸收［13］。

本試驗從竹鼠腸道中分離出2株厭氧纖維素降解菌同屬梭菌屬，并且其同源性與酪酸梭菌相接近。試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，混合菌株產(chǎn)水解圈比較大，而分離培養(yǎng)的菌株產(chǎn)水解圈相對較小且透明度不佳。目前，對于產(chǎn)纖維素降解酶的復(fù)合微生物體系［14－16］和分篩混合菌測酶活力［17－18］的研究已經(jīng)有報道。本試驗基礎(chǔ)上，可以通過測定不同發(fā)酵時間、碳源、氮源、接種量、溫度及初始pH對菌株產(chǎn)酶活力的影響，對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，從而確定這2株纖維素降解菌最佳產(chǎn)酶條件。

4 結(jié)論

從竹鼠盲腸中成功篩選出2株纖維素降解菌，具有較高的纖維素酶活力，經(jīng)鑒定確定屬于梭菌屬。

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