馮 偉 王 玲 張春曉* 宋 凱 張 璐

(1.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門市集美大學(xué)飼料檢測(cè)與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門 361021;2.通威股份有限公司，成都 610041)

魚油作為水產(chǎn)飼料的優(yōu)質(zhì)脂肪源一直備受青睞，但隨著海洋漁業(yè)資源的枯竭和魚類捕撈量的下降，全球魚油總產(chǎn)量銳減。嚴(yán)峻的市場(chǎng)壓力導(dǎo)致了魚油價(jià)格大幅度上升，這使得水產(chǎn)飼料生產(chǎn)企業(yè)越來(lái)越關(guān)注具有開發(fā)前景的脂肪源。中國(guó)是一個(gè)豬油資源十分豐富的國(guó)家，豬油來(lái)源于肥肉的煉制、食品加工等副產(chǎn)品，其高效利用日漸成為一個(gè)十分重要的課題［1］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)［2］、異 育 銀 鯽 (Carassius auratus gibelio)［3］、鯉魚(Cyprinus carpio)［4］、凡納濱對(duì) 蝦(Litopenaeus vannamei)［5］、施 氏鱘 (Acipenser schrenckii)幼 魚［6］、黃 顙 魚 (Pelteobagrus fulvidraco)［7］等水產(chǎn)動(dòng)物上開展了豬油替代魚油的研究。多數(shù)結(jié)果表明魚油作為飼料脂肪源時(shí)，動(dòng)物的生長(zhǎng)性能明顯優(yōu)于豬油組［2-6］。有研究表明，水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)豬油的消化率比魚油低［8］，因此如何提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)豬油的利用是豬油作為魚油替代脂肪源的關(guān)鍵問(wèn)題。乳化劑能有效促進(jìn)脂肪在腸道內(nèi)乳化形成水溶性微粒，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)脂肪的吸收和利用［9-11］。研究表明，在以豬油為主要脂肪源的飼料中添加乳化劑可顯著提高仔豬增重率和飼料效率［12］。

牛蛙原產(chǎn)于北美洲，因其鳴叫聲宏亮酷似牛叫，故名牛蛙。牛蛙肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，膽固醇含量低。同時(shí)牛蛙具有繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在福建、廣東、浙江和海南等省都有大量養(yǎng)殖。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蛙類營(yíng)養(yǎng)生理已有部分研究［13-17］，其中，皇康康等［15］研究發(fā)現(xiàn)，以魚油為脂肪源時(shí)，牛蛙飼料中適宜的脂肪水平為7%。在傳統(tǒng)牛蛙飼料中，魚油仍然是牛蛙飼料的主要脂肪源。因此，尋找替代脂肪源，降低飼料成本，是牛蛙飼料和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)節(jié)支增收的途徑之一。本試驗(yàn)通過(guò)雙因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討飼料中不同脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙生長(zhǎng)性能、體組成、腸道消化酶活力、肝臟生化指標(biāo)的影響，旨在為牛蛙配合飼料中豬油的使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、豆粕為主要蛋白質(zhì)源，分別以豬油(美國(guó)動(dòng)物蛋白及油脂提煉協(xié)會(huì)提供)和魚油為主要脂肪源，配制脂肪水平為7%的2種基礎(chǔ)飼料;另分別向2種基礎(chǔ)飼料中添加300 mg/kg的商用乳化劑(磷脂型復(fù)合乳化劑，由廈門市美爾吉生物科技有限公司提供)，制成2種含乳化劑的飼料。試驗(yàn)共配制4種等氮等能的試驗(yàn)飼料，分別記為D1(7%豬油+不添加乳化劑)、D2(7%豬油+0.03%乳化劑)、D3(7%魚油+不添加乳化劑)、D4(7%魚油+0.03%乳化劑)。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與管理

試驗(yàn)用牛蛙購(gòu)于廈門市同安區(qū)一養(yǎng)殖場(chǎng)，為同一批孵化蛙苗。正式試驗(yàn)前，牛蛙放于室內(nèi)暫養(yǎng)缸(1.5 m×0.7 m×0.6 m)中暫養(yǎng)，以商業(yè)牛蛙膨化飼料(福建省海新集團(tuán)有限公司提供)進(jìn)行投喂，使之逐漸適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。暫養(yǎng)15 d后，將牛蛙饑餓24 h，挑選個(gè)體大小均勻的健康牛蛙隨機(jī)分配到室內(nèi)12個(gè)水族箱(0.7 m×0.4 m×0.4 m)中進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。試驗(yàn)牛蛙初始體重為(19.01±0.01)g，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)(水族箱)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)15只牛蛙。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周。試驗(yàn)期間，水族箱水位4 cm，水溫28～30℃，每天投喂2次(08:00、18:00)，達(dá)表觀飽食狀態(tài)，投喂前30 min對(duì)各缸進(jìn)行換水和清洗。養(yǎng)殖期間記錄牛蛙的攝食和死亡情況。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)開始前，采用雙毀髓法將暫養(yǎng)缸中隨機(jī)挑取的15只牛蛙處理后置于-20℃冰箱中保存，以用于牛蛙初始樣本的分析。8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，然后對(duì)每個(gè)重復(fù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并逐只稱重。分別從每個(gè)缸中隨機(jī)抽取5只牛蛙，用雙毀髓法處理，其中2只牛蛙用于全體成分分析;將另外3只牛蛙解剖，將牛蛙體腔內(nèi)容物取出，稱內(nèi)臟總重，再剝離出肝臟和腸道，稱肝臟重，并迅速截取部分腸道(胃幽門后方2～9 cm處)，置于-80℃冰箱中保存待測(cè)，隨后將這3只取過(guò)內(nèi)臟的牛蛙存放于同一自封袋，置-20℃冰箱中保存待測(cè)牛蛙胴體成分。

1.4 樣品分析

試驗(yàn)原料、飼料、牛蛙全體和胴體中水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量以及總能的測(cè)定參照AOAC(2005)［16］的測(cè)定方法。水分含量采用105℃常壓烘箱干燥法測(cè)定;粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法，用FOSS公司生產(chǎn)的Kjeltec8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定;粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定;粗灰分含量采用馬福爐550℃灼燒法測(cè)定;總能采用氧彈式測(cè)量熱儀(PARR6300，美國(guó))測(cè)定。

將牛蛙前腸樣品用預(yù)冷生理鹽水漂洗，除去內(nèi)容物及結(jié)締組織，濾紙拭干稱重。每只牛蛙取1.0 g腸道樣品加入9倍體積的濃度為0.7%的4℃生理鹽水，冰浴勻漿(10 000 r/min，10 s/次，連續(xù)4次)，3 000 r/min離心10 min，取上清液用于測(cè)腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等消化酶活力。腸道蛋白酶活力測(cè)定采用福林-酚試劑法［17］，蛋白酶活力單位定義:每分鐘內(nèi)分解出1μg酪氨酸的酶量稱為1個(gè)酶活力單位。脂肪酶活力測(cè)定采用化學(xué)比濁法(試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。脂肪酶活力單位定義:在37℃條件下，每克組織蛋白質(zhì)在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1μmol底物為1個(gè)酶活力單位。淀粉酶活力測(cè)定采用碘-淀粉比色法(試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。淀粉酶活力單位定義:組織中每毫克蛋白質(zhì)在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)酶活力單位。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

牛蛙肝臟丙二醛(MDA)含量及過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作均按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 計(jì)算公式

根據(jù)相應(yīng)數(shù)據(jù)，按下式計(jì)算增重率(weight gain rate，WGR，%)、特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR)、攝食量(feed intake，F(xiàn)I)、飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)、肝體比(hepaticsomatic index，HSI)、臟體比(viscerasomatic index，VSI)、氮沉積率(nitrogen retention rate，NRE)和能量沉積率(energy retention rate，ERE)。

式中:Wt為終末牛蛙總重(g);W0為初始牛蛙總重(g);WD為攝食飼料總重(g);Wp為攝入蛋白質(zhì)總量(g);N為牛蛙只數(shù);Nt終末牛蛙只數(shù);N0為初始牛蛙只數(shù);Wv為內(nèi)臟重(g);Wh為肝臟重(g);W為體重(g);Pt為終末牛蛙全體粗蛋白質(zhì)含量(%);P0為初始牛蛙全體粗蛋白質(zhì)含量(%);Et為終末牛蛙全體能量(kJ/g);E0為初始牛蛙全體能量(kJ/g);WE為攝入飼料的總能量(kJ/g)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)分別進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和雙因素方差分析(twoway ANOVA)。若差異顯著，則進(jìn)行Tukey氏多重比較，顯著性水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，D3組與D1組相比，WGR提高了7.41%(P＜0.05)，而 D2組與 D4相比，WGR 和 FI分別提高了 10.74% 和 24.17%(P＜0.05)。D2組與D1組相比，WGR、SGR和 FI分別提高了18.92% 、9.65% 和 35.45%(P＜0.05)，2 組之間 FCR、NRE、ERE、SR、HSI和 VSI均差異不顯著(P＞0.05)。D3組和 D4 組之間 WGR、SGR、FCR、NRE、ERE、SR、FI、HSI和 VSI均差異不顯著(P＞0.05)。雙因素方差分析結(jié)果表明，飼料脂肪源和乳化劑對(duì)WGR、SGR和FI有顯著的交互作用(P＜0.05)。

表2 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary lipid source and emulsifier on growth performance of bullfrog

2.2 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙全體和胴體組成的影響

由表3可知，各組牛蛙全體水分、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。D1組與D3組相比，全體粗脂肪含量差異不顯著(P＞0.05)。D2組與D4組相比，全體粗脂肪含量提高了17.73%(P＜0.05)。D2組較 D1組全體粗脂肪含量提高了21.60%(P＜0.05)。D3 組與 D4 組之間全體粗脂肪含量差異不顯著(P＞0.05)。飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙全體水分和粗脂肪含量有顯著的交互作用(P＜0.05)。各組牛蛙胴體水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，且飼料脂肪源和乳化劑對(duì)胴體上述成分無(wú)顯著的交互作用(P＞0.05)。

表3 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙全體和胴體組成的影響Table 3 Effects of dietary lipid source and emulsifier on whole-body and carcass composition of bullfrog %

2.3 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙腸道消化酶活力的影響

由表4可知，在不同脂肪源的飼料中添加乳化劑對(duì)腸道蛋白酶和淀粉酶活力均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。D3組與D1組相比，腸道脂肪酶活性提高了40.61%(P＜0.05)。相同脂肪源的各組中，D2組較D1組腸道脂肪酶活性提高了62.58%(P＜0.05)，D3組與D4組腸道脂肪酶活力沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙腸道脂肪酶活力有顯著的交互作用(P＜0.05)。

表4 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影響Table 4 Effects of dietary lipid source and emulsifier on protease，lipase and amylase activities in intestine of bullfrog

2.4 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙肝臟生化指標(biāo)的影響

由表5可知，在不同脂肪源的飼料中添加乳化劑對(duì)牛蛙肝臟CAT和SOD活力無(wú)顯著影響(P＞0.05)。D3組與 D1組相比，肝臟 MDA含量提高了18.87%(P＜0.05)。相同脂肪源的各組中，D2組較D1組肝臟MDA含量提高了18.87%(P＜0.05)，D3組與D4組之間肝臟 MDA含量差異不顯著(P＞0.05)。飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛 蛙肝臟MDA含量有顯著的交互作用(P＜0.05)。

表5 飼料脂肪源和乳化劑對(duì)牛蛙肝臟生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of dietary lipid source and emulsifier on hepatic biochemical indexes of bullfrog

3 討論

不同的脂肪源存在不同的脂肪酸組成及比例，而脂肪酸的組成及比例可對(duì)魚類生長(zhǎng)產(chǎn)生影響［18］。在對(duì)草魚(Ctenopharyngodon idellus)［19］、羅非魚(Oreochromis niloticus)［20］和異育銀鯽［3］的研究中發(fā)現(xiàn)，不同脂肪源對(duì)于魚類生長(zhǎng)有顯著影響，且魚油組生長(zhǎng)效果好于豬油組。導(dǎo)致該試驗(yàn)結(jié)果的原因可能有以下2方面:一方面是魚油中富含對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有重要生理功能的高不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFAs)［21］，另一方面是魚油富含的不飽和脂肪酸較豬油富含的飽和脂肪酸更易消化吸收［22］。在本試驗(yàn)中，D1組WGR和FI顯著低于D3組，但2組之間FCR差異不顯著，這表明較低的FI可能是導(dǎo)致豬油組生長(zhǎng)較差的原因。本試驗(yàn)的結(jié)果也說(shuō)明，與豬油相比，魚油對(duì)牛蛙有更好地促攝食作用。

在本試驗(yàn)中，D2組的WGR和SGR顯著高于D1組和D3組，相似結(jié)果也出現(xiàn)在對(duì)團(tuán)頭魴［9］和肉雞［10，23］的研究中。這說(shuō)明，飼料中添加乳化劑可以提高豬油作為脂肪源的使用效果。然而，飼料中添加乳化劑并沒(méi)有改善魚油組的生長(zhǎng)性能。一般而言，多不飽和脂肪酸自身具有較高的乳化能力，通常比飽和脂肪酸更容易形成微團(tuán)［24］，含有大量多不飽和脂肪酸的魚油能夠被動(dòng)物很好地利用，因而牛蛙飼料中乳化劑的添加對(duì)于魚油利用率的改善效果不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)D2組FI顯著高于D1組，而D3組與D4組FI差異不顯著，說(shuō)明飼料中添加乳化劑改善了豬油組飼料的適口性。各組之間FCR均無(wú)顯著差異，說(shuō)明D2組牛蛙FI的增加是其WGR提高的主要原因。D1組與D3組相比，其FI更低，而FCR、NRE和 ERE相似，即低攝食水平下牛蛙對(duì)以豬油為主要脂肪源飼料的利用率與高攝食水平下牛蛙對(duì)以魚油為主要脂肪源飼料的利用率相似，說(shuō)明牛蛙對(duì)食物的消化能力影響其攝食量，牛蛙可能通過(guò)攝食的調(diào)節(jié)以維持穩(wěn)定的對(duì)食物的利用率。

已有研究表明，飼料組成對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物體組成有重要影響［25］。潘瑜等［4］報(bào)道，用魚油、豆油、菜籽油、亞麻籽油和豬油為脂肪源的5種試驗(yàn)飼料投喂鯉魚8周后，魚油組全魚粗脂肪含量最低，豬油組全魚粗脂肪含量最高。研究人員認(rèn)為這可能是因?yàn)轸~油富含n-3HUFA，可通過(guò)抑制脂肪合成來(lái)降低脂肪沉積量［26］。在小鼠上的研究也發(fā)現(xiàn)，HUFA抑制脂肪生成是通過(guò)下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP-1)的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，并相應(yīng)地降低脂肪生成酶 mRNA 的表達(dá)［27］。徐后國(guó)［28］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加飽和脂肪酸顯著增加了鱸魚幼魚機(jī)體及組織脂肪含量。然而，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在D1組和D3組，牛蛙全體和胴體中營(yíng)養(yǎng)成分沒(méi)有因?yàn)轱暳现兄饕驹吹牟煌l(fā)生變化，可能是因?yàn)镈1組FI顯著低于D3組，因而可用于體內(nèi)沉積的脂肪含量較少，不足以改變牛蛙機(jī)體組成。本試驗(yàn)中，D2組全體粗脂肪含量顯著高于D1組，而在以魚油為主要脂肪源的飼料中添加乳化劑并未顯著影響牛蛙全體營(yíng)養(yǎng)成分含量。這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)在飼料中添加乳化劑顯著提高了豬油組的FI，使得牛蛙消化吸收更多的飽和脂肪酸，從而導(dǎo)致D2組體脂肪沉積量增加。

腸道消化酶的活力是反映腸道對(duì)食物中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等消化能力的重要指標(biāo)。有研究表明，脂肪酶的分泌會(huì)受到飼料中脂肪的誘導(dǎo)，脂肪酶的活力與飼料中的脂肪水平具有相關(guān)性［29］。宋理平等［30］研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料脂肪水平的升高，厚唇弱濟(jì) (Hephaestus fuliginosus)腸道脂肪酶活力也隨之升高。在對(duì)金頭鯛(Sparus aurata)［31］和 翹 嘴 紅 鲌 (Erythroculter ilishaeformis)［32］的研究中也得到相似的結(jié)果。從本試驗(yàn)研究結(jié)果來(lái)看，D3組較D1組有更高的腸道脂肪酶活力和FI，可能是因?yàn)轸~油組通過(guò)攝食更多的脂肪而刺激牛蛙分泌更多的脂肪酶。本試驗(yàn)中，D2組腸道脂肪酶活力顯著高于D1組，這可能是因?yàn)镈2組具有較高的FI，從而單位時(shí)間內(nèi)攝入更多脂肪，刺激分泌更多的脂肪酶，同時(shí)在乳化劑的作用下，脂肪乳化分散更易被脂肪酶分解而產(chǎn)生更多的脂肪酸，而脂肪酸可通過(guò)刺激膽囊收縮素釋放而促進(jìn)胰腺分泌消化酶［33］。同時(shí)，在本試驗(yàn)中，在以魚油為脂肪源的飼料中添加乳化劑并未顯著影響腸道脂肪酶的活力，可能是2組之間相似的FI所致。

動(dòng)物機(jī)體的抗氧化水平在一定程度上反映機(jī)體的健康狀況。SOD和CAT存在于生物體各種組織中，可以消除超氧陰離子自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，使機(jī)體免受損傷［34］。MDA被認(rèn)為是體內(nèi)脂肪酸過(guò)氧化物的產(chǎn)物，其組織含量是肝臟損傷程度的指標(biāo)［35］。本試驗(yàn)中，D3組肝臟MDA含量顯著高于D1組。Huang等［20］研究也發(fā)現(xiàn)攝食以魚油為主要脂肪源飼料的羅非魚，其肝胰臟MDA含量高于攝食以豬油為主要脂肪源飼料的羅非魚，這可能是因?yàn)轸~油富含HUFA，而HUFA因其高度不飽和性而容易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化。另外，本試驗(yàn)中，D2組MDA含量顯著高于D1組。皇康康等［15］研究發(fā)現(xiàn)牛蛙肝臟MDA的含量隨飼料脂肪水平的增加而顯著升高。張春暖等［36］研究也發(fā)現(xiàn)梭魚(Chelon haematocheilus)肝臟MDA含量隨飼料脂肪水平的增加而升高，表明外源脂肪的添加對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化有一定的誘導(dǎo)作用。本試驗(yàn)中各組飼料脂肪水平一致，但D2組牛蛙較D1組有更高的FI，因而導(dǎo)致其更高的肝臟MDA含量。而D3組與D4組牛蛙的FI相似，因而二者肝臟MDA含量差異不顯著。

4 結(jié)論

在飼料脂肪水平為7%條件下，飼料中以豬油為主要脂肪源時(shí)添加0.03%乳化劑能提高牛蛙的FI和腸道消化酶的活力，并促進(jìn)牛蛙生長(zhǎng)。

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