李興芳 徐 雯 張勝男 徐高蹺 汪珊如 王士長(zhǎng) 梁世忠*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005;2.南寧學(xué)院，南寧 530200)

單寧是是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，味澀，并且具有抑菌作用，影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用［1-3］。降解單寧的微生物能夠分泌一種酶，此酶可以對(duì)單寧產(chǎn)生抗性并使單寧發(fā)生降解［4-7］。

一些家畜和野生動(dòng)物(如綿羊、山羊、鹿和麋鹿)的消化道中有單寧降解菌，有助于這些動(dòng)物利用高單寧飼料。Skene等［8］于1995年首次從飼喂富含單寧牧草的山羊瘤胃中分離出了的厭氧菌反芻月形單胞菌(Selenomonas ruminantium)，該菌不僅能夠降解單寧，還可以利用其降解產(chǎn)物;Odenyo等［9］在一些非洲反芻動(dòng)物的瘤胃液中也發(fā)現(xiàn)耐受單寧或降解單寧的微生物;Goel等［10］從沒(méi)有采食含單寧飼糧的山羊糞便中分離到6株可以分解單寧-蛋白質(zhì)結(jié)合物的革蘭氏陽(yáng)性球菌(gram-positive cocci)，并通過(guò)分析證明它們屬于不同的D型糞鏈球菌(Enterococcus faecalis)，其中降解單寧能力最強(qiáng)的糞鏈球菌GF1在含單寧4%的培養(yǎng)基上也可以正常生長(zhǎng);Singh［11］從放養(yǎng)山羊瘤胃中分離出16株厭氧單寧降解菌，其中1株菌能夠耐受3.5%的單寧酸，并且能將單寧降解為沒(méi)食子酸和焦棓酸，經(jīng)分子生物學(xué)法鑒定為路德維希腸桿菌(Enterobacter ludwigii)GRT-1。

本試驗(yàn)從采食富含單寧的植物的原生態(tài)山羊瘤胃中分離好氧及兼性厭氧的細(xì)菌，通過(guò)單寧濃度耐受培養(yǎng)基和單寧酶活力鑒定培養(yǎng)基篩選降解單寧的細(xì)菌，并通過(guò)16S rDNA基因序列測(cè)定分析對(duì)4株菌進(jìn)行初步鑒定，再將菌株在單寧濃度為0.5%、1%、1.5%的單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行胞內(nèi)酶活力測(cè)定，以期為單寧降解菌在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑及主要來(lái)源

沒(méi)食子酸丙酯:購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。單寧酸(分子質(zhì)量1 701.20 ku)、蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂、Taq酶、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、X-gal、DNA Marker DL2000、胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素(Sigma分裝)、氯化鈉、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸、氫氧化鈉、飽和酚、氯仿、異戊醇、蛋白酶K、溶菌酶、十二烷基硫酸鈉、檸檬酸、Tris、冰乙酸、無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。引物:上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 樣品采集

采集廣西省天然山林放牧養(yǎng)殖的隆林山羊瘤胃，在無(wú)菌環(huán)境下刮取瘤胃上皮和取瘤胃內(nèi)容物，過(guò)濾將樣品的固液相分離，立即用于菌株分離。

1.1.3 培養(yǎng)基

單寧濃度耐受培養(yǎng)基:牛肉浸膏2.5 g，蛋白胨 5 g，瓊脂 6 g，氯化鈉 2.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到450 mL，pH 7.2，滅菌，分別添加10%、20%、30%、40%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，混合。得到的培養(yǎng)基單寧濃度分別為1%、2%、3%、4%。另配制用蒸餾水代替單寧酸水溶液的不含單寧的普通培養(yǎng)基。

單寧酶鑒定培養(yǎng)基a:牛肉浸膏2.5 g，氯化鈉2.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，蛋白胨 5 g，瓊脂 6 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到400 mL，pH 4.5，滅菌，加15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，加0.04%的溴酚藍(lán)水溶液50 mL，混合。

單寧酶鑒定培養(yǎng)基b:瓊脂6 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到 400 mL，pH 4.5，滅菌，加15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，加0.04%的溴酚藍(lán)水溶液50 mL，混合。

單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(液體):牛肉浸膏2.5 g，蛋白胨5 g，氯化鈉 2.5 g，磷酸氫二鉀 1 g，50 mL滅菌瘤胃液，超純水定容到 450 mL，pH 7.2，滅菌，分別添加5%、10%、15%的滅菌單寧酸水溶液50 mL，混合。得到的培養(yǎng)基單寧濃度分別為0.5% 、1% 、1.5% 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選［11］

1.2.1.1 初篩

設(shè) A、B、C、D 4組，每組3個(gè)重復(fù)。A、B 組接種瘤胃液，C、D組接種瘤胃固相內(nèi)容物;A、C組0.27×10-3×g 37 ℃ 搖床過(guò)夜培養(yǎng);B、D 組放于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。然后將A、B、C、D 4組富集培養(yǎng)的細(xì)菌接種到24個(gè)不加單寧的普通培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)。再將24個(gè)培養(yǎng)基上的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到含不同單寧濃度耐受培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，將菌落純化后，保存。

1.2.1.2 復(fù)篩

1)將篩選出的幾株菌分別接種到含單寧酶鑒定培養(yǎng)基a和b上，當(dāng)菌落周圍顏色變?yōu)辄S色，則證明有單寧酶產(chǎn)生，觀察顏色的變化，從而確定出酶活力較強(qiáng)的幾株菌。

2)將1)中篩出的幾株菌分別接種到不同單寧酶鑒定培養(yǎng)基上培養(yǎng)，比較酶活力。

3)將篩選出活力較高的菌株，分別接種于10 mL單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃ 0.27×10-3×g振蕩培養(yǎng)16～24 h，-80℃保存，用于菌株鑒定和酶活力測(cè)定。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 所篩菌株基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增

提取所篩選菌株的基因組DNA，選用細(xì)菌通用引物，上游27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTGAG-3';下游 1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。對(duì)山羊瘤胃內(nèi)單寧降解菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，終體積為25μL，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，共 30 個(gè)循環(huán)［12］。1.2.2.2 PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

取2～3μL產(chǎn)物與1μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，上樣到1%的瓊脂糖凝膠孔中，在100 V 60 mA條件下，電泳60 min，放置于溴化乙錠(EB)中染色15～20 min，并在紫外分析儀下觀測(cè)，然后放于凝膠成像系統(tǒng)中拍照，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 PCR 產(chǎn)物的克隆及測(cè)序

純化與載體連接:采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。連接反應(yīng)采用pGEM-T載體試劑盒，將準(zhǔn)備好的反應(yīng)體系放于4℃孵育過(guò)夜，得到最大數(shù)目的轉(zhuǎn)化菌落。

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:1)輕微離心使連接產(chǎn)物匯集到管底，取2μL連接產(chǎn)物加到置于冰上的1.5 mL離心中，向管中加入50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，并在冰浴中放置30min;2)42℃水浴中熱激45 s后快速轉(zhuǎn)至冰浴中2 min，注意在此過(guò)程不要搖動(dòng)離心管;3)向離心管中加入滅菌的500μL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混合均勻后在37℃ 0.76×10-3×g條件下培養(yǎng)1 h，復(fù)蘇細(xì)菌;4)分別取200μL已轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基涂到2個(gè)LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，37℃正向放置1～2 h后，倒置過(guò)夜培養(yǎng);5)將過(guò)夜培養(yǎng)的平板放于4℃2～3 h后，每個(gè)平板挑取5個(gè)白色菌落分別接種于10 mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

陽(yáng)性克隆的鑒定及測(cè)序:采用一種簡(jiǎn)單的酚/氯仿/異戊醇抽提法，將重組質(zhì)粒DNA抽提出來(lái)，鑒定出陽(yáng)性重組子。鑒定出的陽(yáng)性克隆直接進(jìn)行菌液PCR，再一次鑒定陽(yáng)性克隆，將菌液直接送于華大基因公司測(cè)序。

1.2.3 單寧酶活力測(cè)定

采用沒(méi)食子酸丙酯作為單寧酶的底物。沒(méi)食子酸丙酯的濃度會(huì)隨著酶促反應(yīng)的進(jìn)行而變小，從而引起在270 nm處的吸光值(OD)降低，根據(jù)沒(méi)食子酸丙酯吸光值的變化，計(jì)算出單寧酶的活力。將篩選得到的菌株接種到單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(單寧濃度0.5%、1%和1.5%)中，37 ℃，120 r/min 震蕩培養(yǎng)，待 OD600nm約為0.4～0.6時(shí)，收集菌體，加入36 μL的溶菌酶(50 mg/mL)和3μL的Triton-100，37℃水浴15 min后，制得粗酶液，立即進(jìn)行酶活力測(cè)定。酶活力的定義:40℃反應(yīng)條件下，100μL酶液每分鐘使沒(méi)食子酸丙酯溶液在270 nm處減少0.01個(gè)吸光度值定義為1個(gè)酶活力單位。

酶活力計(jì)算公式:

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，選出了4株菌，編號(hào)為No.1、No.2、No.3、No.4，結(jié)果表明，4 株菌對(duì)單寧的最大耐受濃度均為4%，但No.2、No.3 2株菌的長(zhǎng)勢(shì)比No.1和No.4要好一些，通過(guò)單寧酶鑒定培養(yǎng)基看出菌株可以產(chǎn)生單寧酶，并且可以看出細(xì)菌在只有瓊脂和溴酚藍(lán)的單寧酶鑒定培養(yǎng)基b上與在含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溴酚藍(lán)的單寧酶鑒定培養(yǎng)基a上相比生長(zhǎng)緩慢，菌落周圍變色緩慢，并且變色范圍比較小，因此說(shuō)明直接利用單寧作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力很低。部分菌株的單寧耐受情況見(jiàn)圖1，部分菌株單寧酶初步鑒定結(jié)果如圖2。

圖1 No.3菌株在不同單寧濃度耐受培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況Fig.1 The growth status of the No.3 strain on tolerance culture medium with different tannic concentration

圖2 No.2菌株在單寧酶鑒定培養(yǎng)基a(A)和b(B)上的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth status of No.2 strain on tannase identification culture mediums a(A)and b(B)

2.2 16S r DNA基因組序列測(cè)序結(jié)果

將測(cè)序所得序列提交至GenBank進(jìn)行Blast序列同源性比對(duì)。選取若干同源性較高的16S rDNA序列經(jīng)ClustalX1.84程序進(jìn)行比對(duì)，采用 Kimura4參數(shù)模型計(jì)算進(jìn)化距離通過(guò)鄰接法和最大簡(jiǎn)約法，運(yùn)用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示。No.1菌株與登錄號(hào)為EF192136的細(xì)菌親緣關(guān)系最近，該菌屬于腸桿菌目，腸桿菌科，普羅威登斯菌屬，進(jìn)一步比對(duì)得出No.1菌株屬于產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providencia alcalifaciens);No.2菌株與4株細(xì)菌親緣關(guān)系均比較近，基本都屬于伯克氏菌目，但經(jīng)分析判斷No.2菌株與克斯特菌屬親緣關(guān)系更為接近，因此屬于克斯特菌(Kerstersia);No.3菌株介于2大分支菌之間，但是更接近于下面1個(gè)分支菌，該菌也屬于普羅威登斯菌屬，通過(guò)比對(duì)得知No.3菌株為Providencia vermicola;No.4菌株與11株細(xì)菌親緣關(guān)系均較近，均屬于假單胞菌菌科，經(jīng)進(jìn)一步分析得知屬于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

圖3 4株細(xì)菌與其同源細(xì)菌的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic trees of the four strains and homologous bacteria

2.3 4株篩選菌株的單寧酶活力

由表1可知，各單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均為No.2菌株的酶活力最高。各單寧濃度組酶活力比較得知，除了No.1菌株在0.5%組的單寧酶活力最大外，其他3株菌均在1%組具有最大酶活力，且這3株菌在1%組的酶活力均顯著高于0.5%與1.5%組(P＜0.05);通過(guò) 0.5%組與1.5%組比較得知，除了No.4菌株在0.5%組低于1.5%組外，其他3株都與之相反。以上分析表明，單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基1%的單寧濃度對(duì)于菌株單寧酶的產(chǎn)生具有很好的誘導(dǎo)作用，而0.5%和1.5%濃度組誘導(dǎo)作用略差，原因可能是濃度太小對(duì)菌株的刺激作用太小，而濃度太大又會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)及單寧酶的產(chǎn)生起到抑制作用。

表1 單寧酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基單寧濃度對(duì)4株細(xì)菌酶活力的影響Table 1 Effects of tannin concentration of tannase inductive culture medium on enzyme activities of the four screened strains U/mL

3 討論

培養(yǎng)基的成分對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)所需的培養(yǎng)基，一般采用目前通用的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基即可，但是鑒于本試驗(yàn)中所篩菌株的特殊性，考慮到山羊瘤胃液中可能存在菌株生長(zhǎng)所需的特殊物質(zhì)，因此在配制培養(yǎng)基時(shí)，均加入了10%的滅菌山羊瘤胃液，通過(guò)比較顯示，加入瘤胃液后，菌株的生長(zhǎng)狀況確實(shí)要好一些。

本試驗(yàn)所篩選的菌株能夠在含單寧的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只能說(shuō)明菌株能夠抵抗單寧的抑菌作用，并不能說(shuō)明可以產(chǎn)生單寧酶而降解單寧，因此對(duì)于單寧降解菌的篩選需要一定的方法。目前所建立的篩選鑒定方法都是針對(duì)青霉與曲霉等真菌的。1977年Bradoo等［13］在培養(yǎng)基中只加入1%的單寧和3%的瓊脂，將菌株點(diǎn)種在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，觀察菌落周圍的透明圈，把透明圈直徑與菌落直徑的比值作為篩選鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。2001年，郭魯宏［14］改進(jìn)了篩選鑒定方法，在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為0.004%的溴酚藍(lán)，利用菌落周圍培養(yǎng)基顏色變化范圍的大小與變色的程度直觀地判斷菌株是否可以產(chǎn)生單寧酶，以及產(chǎn)酶能力的大小。2008年，保玉心［15］也利用這種方法對(duì)其試驗(yàn)菌株做了篩選鑒定，效果比較明顯，從而更好地證明了這種方法的可行性。因?yàn)楸驹囋嚭Y選的是細(xì)菌，因此針對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)需要，培養(yǎng)基也需要相應(yīng)改變，本試驗(yàn)培養(yǎng)基需要在細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入1%的單寧和0.004%的溴酚藍(lán)進(jìn)行培養(yǎng)。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于單寧酶基因的報(bào)道都比較少，而現(xiàn)在可用于克隆表達(dá)且相對(duì)比較成功的一般是真菌的單寧酶基因，許彬［16］將米曲霉(Aspergillus oryzae)中單寧酶基因克隆于大腸桿菌和畢赤酵母中，并得到成功表達(dá);黃小鳳等［17］又將Aspergillus oryzae中單寧酶基因成功的克隆表達(dá)在了黑曲霉中。對(duì)于細(xì)菌的單寧酶基因克隆表達(dá)也有相關(guān)報(bào)道，Noguchi等［18］從路鄧葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)中克隆了能夠編碼613個(gè)氨基酸，并能夠表達(dá)單寧酶活力的基因tanA，同時(shí)他們?cè)赟taphylococcus lugdunensis、植物乳桿菌(L.plantarum)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)和解沒(méi)食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)等菌種中用tanA目標(biāo)探針進(jìn)行了Southen blot印記分析，發(fā)現(xiàn)探針只在鄧葡萄球菌中有明確反應(yīng);Rodrígueza 等［19］從植物乳酸菌 ATCC 14917T中克隆出了單寧酶的編碼基因tanLpl，并且在所有L.plantarum中進(jìn)行了tanLpl基因的PCR擴(kuò)增，得到了預(yù)期片段大小的目的DNA片段，在L.plantarum、類植物乳桿菌(L.paraplantarum)、L.pentosus和S.gallolyticus中進(jìn)行了 Southen blot印記分析，結(jié)果表明在前2種菌中都有明顯反應(yīng)。本試驗(yàn)對(duì)于單寧酶基因的擴(kuò)增，所得的結(jié)果并不理想，因此后續(xù)試驗(yàn)還可以通過(guò)現(xiàn)有報(bào)道的產(chǎn)單寧酶菌株的單寧酶基因序列來(lái)設(shè)計(jì)合適的引物，擴(kuò)增所得菌株的單寧酶基因序列，或者應(yīng)用已知單寧酶基因片段做探針，對(duì)所篩菌的DNA進(jìn)行Southern印跡雜交，從而找到所篩菌株的單寧酶基因，為以后將單寧酶基因克隆到合適的有益菌中，用于發(fā)酵香蕉葉來(lái)降低單寧含量或用于食品、化妝品等行業(yè)做準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

①山羊瘤胃中存在能夠降解單寧的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)法鑒定，分別為Providencia alcalifaciens、Kerstersia、Providencia Vermicola 和 Pseudomonas aeruginosa。

②篩選出的4株菌單寧酶活力均較高，對(duì)單寧的最大耐受度均可達(dá)到4%。

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