黃芳芳，何長青，閆麗君，汪靈丹，徐剛標(biāo)

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院 林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

觀光木SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

黃芳芳，何長青，閆麗君，汪靈丹，徐剛標(biāo)

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院 林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化影響觀光木SSR-PCR擴(kuò)增的5種主要影響因素，獲得最佳反應(yīng)體系（10 μL）為：Mg2+1.0 mmol，dNTP 0.20 mmol，引物0.25 μmol，TaqDNA聚合酶0.75 U，模板DNA 60 ng。利用優(yōu)化SSR-PCR擴(kuò)增體系，從12對引物中篩選出5對多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物。這為進(jìn)一步開展觀光木種群遺傳多樣性研究奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

觀光木；SSR；體系優(yōu)化；引物篩選

觀光木Tsoongiodendron odorumChun，屬木蘭科Magnoliaceae植物，為古老的孑遺樹種，是著名的觀賞樹種，被列為我國二級珍稀瀕危重點(diǎn)保護(hù)植物。觀光木零星分布我國福建、海南、廣東、廣西、江西南部、貴州南部、云南東南部、湖南南部以及越南等地海拔300～1 100 m山地常綠闊葉林中、林緣以及村旁、房前屋后[1-2]。目前，觀光木的研究主要集中在生物量循環(huán)、種群生態(tài)生理、生殖生物學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育等基礎(chǔ)生物學(xué)等方面[3-5]，近期開展的觀光木種群遺傳多樣性研究主要采用RAPD、ISSR[5-8]標(biāo)記。由于RAPD和ISSR標(biāo)記為顯性標(biāo)記，估算的種群遺傳學(xué)參數(shù)是基于種群遺傳平衡假說，與真實(shí)情況存在偏差。共顯性SSR標(biāo)記是揭示瀕危植物遺傳多樣性、基因流模式及小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)首選分子標(biāo)記[9]，因此，為了探討觀光木種群進(jìn)化機(jī)制，預(yù)期其小種群未來命運(yùn)，開展SSR標(biāo)記分析顯得尤為迫切。

本研究擬通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，旨在建立出一套適合觀光木種群遺傳多樣性分析SSRPCR擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)化體系，利用優(yōu)化體系對近期開發(fā)的12對觀光木特異SSR引物[10]進(jìn)行篩選，以期為進(jìn)一步基于SSR標(biāo)記開展觀光木種群遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

觀光木新鮮葉片置于密封袋中硅膠干燥處理后，-4℃冰箱保存。參考文獻(xiàn)[10]中SSR特異引物 TOD8(F：CCCCATTGAAGTCATTTGAAG，R：ATCCCATGCGATAACCGATA)進(jìn)行SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測

觀光木基因組DNA提取、檢測參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[9]，SSR-PCR擴(kuò)增初始反應(yīng)體系（10 μL）：50 ng DNA，1 μL 10×PCR buffer，0.2 μmol引物，1.5 mmol MgCl2，0.2 mmol dNTP，1 UTaqDNA聚合酶。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，57℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以SSR-PCR擴(kuò)增初始反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，對影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA 5個(gè)主要因素分別進(jìn)行優(yōu)化。其中，Mg2+濃度范圍為0.5～3.0 mmol，梯度為0.5 mmol； dNTP濃度范圍為0.05～0.30 mmol，梯度為0.05 mmol；引物濃度范圍為0.10～0.35 μmol梯度為0.05 μmol；Taq酶用量為0.25～1.50 U，梯度為0.25 U；模板DNA用量為15～90 ng，梯度為15 ng。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)確定的各因素最適濃度范圍基礎(chǔ)上，利用L16(44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），確定適合觀光木SSR-PCR擴(kuò)增的最優(yōu)反應(yīng)體系。

1.2.5 退火溫度確定

以由Tm值計(jì)算出的理論退火溫度57℃為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行梯度為1℃的6個(gè)退火溫度（55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃）試驗(yàn)，確定最適退火溫度。

1.2.6 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

[12]。

1.2.7 引物篩選

基于優(yōu)化的觀光木SSR-PCR反應(yīng)體系，對文獻(xiàn)[10]中12對引物進(jìn)行篩選。

1.2.8 最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證

利用已優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系，對17株樣本進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，驗(yàn)證該體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR-PCR反應(yīng)體系單因素試驗(yàn)

影響PCR反應(yīng)體系的5個(gè)主要因子的6個(gè)梯度擴(kuò)增結(jié)果見圖1。Mg2+：第1到第3條帶隨著Mg2+濃度的升高，條帶逐漸變亮且數(shù)量增多，但是Mg2+濃度再升高條帶亮度反而變?nèi)酰琈g2+在1.0 mmol時(shí)條帶清晰明亮且特異性高。dNTP：6個(gè)濃度下的dNTP均擴(kuò)增出產(chǎn)物，濃度越高條帶越亮，濃度在0.15 mmol之后亮度基本無變化，故dNTP濃度在0.15～0.20 mmol之間均可。引物：引物濃度在很低時(shí)，擴(kuò)增的條帶不清晰，隨引物濃度升高，條帶逐漸變清晰，濃度達(dá)到0.25 μmol時(shí)最清晰。TaqDNA聚合酶：不同濃度的Taq酶均可擴(kuò)增出條帶，濃度為0.75U時(shí)，擴(kuò)增條帶最清晰。模板DNA：不同模板用量對SSR-PCR擴(kuò)增影響不明顯，當(dāng)模板DNA用量為60 ng時(shí)，條帶最清晰。

2.2 SSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)

如圖2正交試驗(yàn)結(jié)果所示，16個(gè)不同處理均可擴(kuò)增出條帶，其中第3個(gè)處理組合條件下擴(kuò)增出的條帶比較清晰明亮，最終確定為本試驗(yàn)的最優(yōu)組合，即10 μL體系中含Mg2+1.0 mmol，dNTP 0.20 mmol，引物0.25 μmol，TaqDNA聚合酶0.75 U。

2.3 退火溫度

不同退火溫度擴(kuò)增條帶見圖3，6個(gè)溫度均能擴(kuò)增出清晰的條帶，條帶由亮變暗然后又變亮。其中，58℃時(shí)條帶最暗，56℃時(shí)最亮，據(jù)此把引物TOD8最適退火溫度確定為56℃。

圖1 單因素對 SSR-PCR 擴(kuò)增的影響Fig.1 Effects of each factor on SSR-PCR

圖2 觀光木 SSR-PCR 正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of SSR-PCR by orthogonal design of T. odorum

圖3 退火溫度對 SSR-PCR 的影響Fig.3 Effects of annealing temperature on SSR-PCR

2.4 引物篩選

利用確立的優(yōu)化體系，篩選出5對條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高的SSR引物，見表2。

2.5 最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證

5對SSR引物對17株觀光木樣本進(jìn)行最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證結(jié)果，如圖4所示。從圖4可以看出，5對引物都能擴(kuò)增出清晰的條帶，說明優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系比較穩(wěn)定，可以滿足對觀光木SSR遺傳多樣性研究的需要。

表2 篩選的5對引物Table 2 Screened 5 paris of primes

3 討 論

SSR分子標(biāo)記廣泛存在于各種真核生物的基因組中，呈共顯性遺傳，具有豐富的多態(tài)性和信息量。SSR標(biāo)記具有物種特異性強(qiáng)、模板DNA用量少、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是目前植物種群遺傳學(xué)分析和植物輔助育種最理想標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于種群遺傳多樣性、分子輔助育種、基因定位、種質(zhì)資源鑒定、遺傳連鎖圖譜繪制等研究中[13-16]。

圖4 優(yōu)化的反應(yīng)體系對17株觀光木樣本的SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 SSR-PCR amplification results of 17 T. odorum samples by the optimal reaction system

穩(wěn)定的SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)化體系，是進(jìn)一步開展基因分型分析的前提條件[17]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)受到Mg2+、dNTP、引物濃度，以及模板DNA、TaqDNA聚合酶用量等因素的交互作用影響[18]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑，濃度過低降低Taq酶活力，過高導(dǎo)致Taq酶催化非特異擴(kuò)增；dNTP是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的底物，濃度過低影響擴(kuò)增效率，過高降低Taq酶活性；引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，濃度過低擴(kuò)增產(chǎn)物量少，過高促進(jìn)非特異性擴(kuò)增并增加引物二聚體的形成；模板是待擴(kuò)增序列的核酸，濃度過低減少目的序列的擴(kuò)增量，過高增加非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；Taq酶是 PCR反應(yīng)中的催化劑，用量過少靶序列產(chǎn)量將降低，過多導(dǎo)致非特異產(chǎn)物增加[19]。

退火溫度是影響SSR引物與模板特異性結(jié)合，不同引物因其堿基序列不同，退火溫度不同。退火溫度太低，導(dǎo)致非特異的DNA片段擴(kuò)增，特異性差；退火溫度太高，引物不能與模板很好地結(jié)合，擴(kuò)增產(chǎn)物很低[20]。本研究通過設(shè)計(jì)幾個(gè)不同溫度梯度，重復(fù)試驗(yàn)，獲得了各SSR引物的適宜退火溫度。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是針對多因素、多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，具有高效率、快速、經(jīng)濟(jì)特點(diǎn)，能分析各因素水平組合的交互作用，使試驗(yàn)結(jié)果簡便、科學(xué)。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化影響觀光木SSR-PCR反應(yīng)體系各因素水平，建立了一套適用于觀光木的最佳SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。利用優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系，對來自不同種群的17株觀光木樣本經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)，從12對引物中篩選出5對條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的引物，為后期觀光木遺傳多樣性、小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)、交配系統(tǒng)及基因流分析，以及進(jìn)一步探討觀光木種群進(jìn)化歷史及預(yù)測其片斷化小種群的未來命運(yùn)，奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Optimization of SSR-PCR Reaction System and Prime Screening for Tsoongiodendron odorum

HUANG Fang-fang , HE Chang-qing, YAN Li-jun, WANG Líng-dan, XU Gang-biao
(College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In this paper, the main factors affecting SSR-PCR system ofTsoongiodendron odorumwere optimized through orthogonal design with the samples ofT. odorum, which is based on single factor experiments. SSR-PCR amplytications were performed in a final volume of 10 μL containing 1.0 mmol Mg2+, 0.20 mmol dNTP, 0.25 μmol of each primers, 0.75 UTaqDNA polymerase, 60 ng of genomic DNA. Using the optimized SSR-PCR system 5 primes with high polymorphism and reproducible properties were selected from 12 primes. This paper establishs the foundation for further study of population genetic diversity inT. odorum.

Tsoongiodendron odorum; SSR; Reaction system optimization; Prime screening

S718.46

A

1673-923X(2015)10-0142-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.025

2015-06-23

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201104033）

黃芳芳，碩士研究生

徐剛標(biāo)，教授，博導(dǎo)；E-mail：gangbiaoxu@163.com

黃芳芳，何長青，閆麗君，等. 觀光木SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(10)：142-146.

[本文編校：吳 彬]