莫竹承，龐萬偉 ，劉 玨 ，李 濱

（1. 廣西科學(xué)院廣西紅樹林研究中心，廣西 北海 536000；2. 廣西紅樹林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海536000；3. 北海市林業(yè)局，廣西 北海 536000）

膝柄木葉片誘導(dǎo)愈傷組織研究

莫竹承1,2，龐萬偉3，劉 玨3，李 濱3

（1. 廣西科學(xué)院廣西紅樹林研究中心，廣西 北海 536000；2. 廣西紅樹林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 北海536000；3. 北海市林業(yè)局，廣西 北海 536000）

為了搶救性保護(hù)我國(guó)瀕危植物膝柄木，以葉片外植體為培養(yǎng)材料，在葉片背面劃痕，配制MS培養(yǎng)基附加不同濃度的2,4-D和6-BA，設(shè)置不同的暗培養(yǎng)時(shí)間，做3個(gè)重復(fù)的L3（43）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，探討各因子對(duì)膝柄木葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響。結(jié)果表明各因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響大小順序?yàn)椋喊蹬囵B(yǎng)時(shí)間＞2,4-D＞劃痕數(shù)，6-BA的影響未能達(dá)到顯著水平。誘導(dǎo)膝柄木葉片愈傷組織各因素最佳濃度組合是：2,4-D=1.0 mg/L，6-BA=0.5 mg/L，劃痕=4～5條，暗培養(yǎng)=30天。

膝柄木；葉片；愈傷組織；誘導(dǎo)率

衛(wèi)矛科植物膝柄木最早于1979年在廣西北海市南康鎮(zhèn)下?lián)灞话l(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)定名為庫林木屬華庫林木kurrimiasinicaChang et S.Y. Liang[1]，是我國(guó)特有的熱帶樹種[2]，被收錄入《中國(guó)植物紅皮書》（第一冊(cè)）中。1995年李先琨[3]用定量評(píng)價(jià)指標(biāo)體系評(píng)估了廣西珍稀瀕危植物優(yōu)先保護(hù)序列，把膝柄木Bhesa sinica列入了最優(yōu)先予以保護(hù)的種類。聯(lián)合國(guó)環(huán)境署保護(hù)監(jiān)測(cè)中心2001年的報(bào)告中也將Bhesa sinica收錄為中國(guó)特有瀕危植物[4]。在誠(chéng)靜容和黃普華主編的《中國(guó)植物志》45卷3冊(cè)（1999年）中將膝柄木Bhesa sinica歸并到Bhesa robusta(Roxb.) D. Hou（見 http：//frps.eflora.cn/frps/Bhesa%20robusta）膝柄木Bhesa robusta不再是中國(guó)特有種。1999年國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物（第一批）》名錄中，膝柄木Bhesa robusta為一級(jí)保護(hù)野生植物，在2004年《中國(guó)物種紅色名錄》中將一級(jí)保護(hù)植物膝柄木定為極危（CR）等級(jí)[5]。

膝柄木種群?。ㄎ覈?guó)野生種群不到10株），種子量少且發(fā)芽率低，通過有性繁殖恢復(fù)種群極為困難[6]，探討無性繁殖技術(shù)對(duì)膝柄木種群的保護(hù)有重要意義。膝柄木屬與南蛇藤屬、美登木屬、巧茶屬同屬于衛(wèi)矛亞科Celastroideae南蛇藤族Celastreae。對(duì)與膝柄木同族的其它屬植物，如對(duì)南蛇藤Celastrus orbiculatus[7-8]、苦皮藤Celastrus angulatus[9]、云南美登木Maytenus hookeri[10-11]］等種類開展的組織培養(yǎng)研究均取得了一定的進(jìn)展，因此本文將參照相近親緣種類的組培方案制定膝柄木組培研究方法，探討膝柄木的無性繁殖技術(shù)，為種群的保護(hù)恢復(fù)探索新的技術(shù)路徑。

1 材料與方法

1.1 葉片采集與消毒

在人工種植的膝柄木幼樹上剪取新長(zhǎng)出嫩葉，葉齡一般在10～30日之間，葉片長(zhǎng)約10cm，紅色、淡紅色到嫩綠色，柔軟。

將幼葉帶回實(shí)驗(yàn)室用毛刷擦拭表面，放入燒杯中用流水沖洗1h。先用70%酒精浸泡30秒，無菌水沖洗1次；再用0.1%氯化汞(HgC12)浸泡8 min，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干，在無菌操作臺(tái)上將葉背面劃痕，切除葉中脈，將葉片分割成約2 cm2的小片用于接種。

1.2 接種及培養(yǎng)

按教材配方配制MS固體培養(yǎng)基[12]，瓊脂粉用量為4.0g/L，附加4%蔗糖。培養(yǎng)基附加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為：生長(zhǎng)素類用二氯苯 氧 乙 酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ，簡(jiǎn)稱2,4-D)，細(xì)胞分裂素類用6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，簡(jiǎn) 稱 6-BA 或 BAP)，濃度分別為0.5，1.0，2.0mg/L；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8～6.0，121℃高壓滅菌15 min。接種時(shí)葉片外植體背面與培養(yǎng)基接觸，背面劃痕數(shù)分密（4～5條）、疏（1～2條）和零劃痕3種類型，接種后置于培養(yǎng)架上暗培養(yǎng)10～30天?？疾?種因素（生長(zhǎng)素2,4-D、細(xì)胞分裂素6-BA、劃痕數(shù)和暗培養(yǎng)時(shí)間）對(duì)膝柄木外植體誘導(dǎo)愈傷組織的影響，各因素水平見表1。

表1 膝柄木葉片組培試驗(yàn)各因素水平Table 1 Levels of different factors in leaf segments tissue culture test of Bhesarobusta

將表1中的4因子3水平用L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，共做9組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，每組接種20瓶，每1重復(fù)接種180瓶，每瓶接種1個(gè)葉片外植體，3個(gè)重復(fù)共接種了540瓶。培養(yǎng)第10天按設(shè)計(jì)方案保持暗培養(yǎng)或用日光燈連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 Lx，培養(yǎng)室溫度控制在25℃左右，每隔3d觀察記錄一次愈傷組織發(fā)育情況。當(dāng)遇有發(fā)霉時(shí)立即將外植體消毒轉(zhuǎn)瓶，接種到相同成份的培養(yǎng)基上。

考察指標(biāo)為接種30日后愈傷組織誘導(dǎo)率，計(jì)算方法如下：

誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)／活外植體數(shù))×100%。

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

在實(shí)驗(yàn)過程中觀察記錄發(fā)現(xiàn)：較密的劃痕數(shù)外植體愈傷組織出現(xiàn)較早，在3個(gè)重復(fù)中，劃痕數(shù)4～5條的外植體培養(yǎng)不到20天便開始出現(xiàn)愈傷組織，無劃痕的外植體出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間最遲，通常在培養(yǎng)25～26天才出現(xiàn)。經(jīng)30天培養(yǎng)后愈傷組織誘導(dǎo)率結(jié)果整理于表2.

表2 膝柄木葉片組培實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimantal result of B.robustaleaf segments tissue culture

2.2 各因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

通過單變量方差分析，比較各因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的效應(yīng)，見表3。

結(jié)果顯示：A（2,4-D）、C（劃痕數(shù)）、D（暗培養(yǎng)）的伴隨概率p（表中Sig.）均小于顯著性水平0.05，因此認(rèn)為這3個(gè)因子對(duì)誘導(dǎo)率有顯著影響，其中暗培養(yǎng)影響最大，其次是2,4-D，最后是劃痕數(shù)，6-BA對(duì)誘導(dǎo)率無顯著影響。

表3 因素間效應(yīng)檢驗(yàn)Table 3 Tests of Between-Subjects Effects

2.3 暗培養(yǎng)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

暗培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)這一因素的3個(gè)水平的誘導(dǎo)率分別是水平1（暗培養(yǎng)10天）=83.444%，水平2（暗培養(yǎng)20天）=84.889%，水平3（暗培養(yǎng)30天）=90.556%，基于這些均值采用LSD（最小顯著差異法）進(jìn)行成對(duì)比較得到以下結(jié)果（見表4）。

表4 暗培養(yǎng)各水平成對(duì)比較?Table 4 Pairwise comparisons of dark culture period

結(jié)果表明暗培養(yǎng)水平3與1、2之間的誘導(dǎo)率在0.05水平上有顯著差異，即暗培養(yǎng)30天明顯提高愈傷組織誘導(dǎo)率。

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織的影響

生長(zhǎng)素類激素2,4-D各水平的誘導(dǎo)率均值分別是：水平1=84.111%，水平2=89.778%，水平3=85%，成對(duì)比較結(jié)果見表5。

表5 2,4-D各水平成對(duì)比較?Table 5 Pairwise Comparisons of 2,4-D Concentrations

表中數(shù)據(jù)顯示2,4-D水平2與1、3之間的誘導(dǎo)率有顯著差異，即培養(yǎng)基中2,4-D最佳濃度為1 mg/L。

盡管6-BA在各因素中對(duì)誘導(dǎo)率的影響力不顯著，但因素內(nèi)不水平之間的誘導(dǎo)率可能會(huì)有顯著性差異，為此計(jì)算6-BA各水平的平均誘導(dǎo)率分別是：水平1=89.667%、水平2=84.667%和水平3=84.556%，做成對(duì)比較結(jié)果見表6。

表6 6-BA各水平成對(duì)比較Table 6 Pairwise Comparisons of 6-BA Concentrations

比較結(jié)果表明，6-BA水平1與水平2、3之間的誘導(dǎo)率有顯著差異，即在培養(yǎng)基中6-BA濃度0.5 mg/L比其它兩種較高濃度能明顯提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。

2.5 劃痕對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

劃痕數(shù)的3個(gè)水平的誘導(dǎo)率均值分別是水平1=89.667%，水平2=85.222%，水平3=84%，成對(duì)比較結(jié)果見表7。

表7 劃痕數(shù)各水平成對(duì)比較Table 7 Pairwise comparisons of scratch lines

結(jié)果表明，劃痕數(shù)只有水平1與水平3之間的誘導(dǎo)率有顯著差異，也就是說較密的劃痕（4～5條）比無劃痕外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯較高。

由此可以認(rèn)為這4個(gè)因素的最佳組合是：A2B1C1D3，即 2,4-D=1.0 mg/L，6-BA=0.5 mg/L，劃痕=4～5條（密），暗培養(yǎng)=30天。

考慮到6-BA對(duì)誘導(dǎo)率的貢獻(xiàn)達(dá)不到顯著水平，從節(jié)約資源的角度考慮可以省掉，變成3因素組合，即A2C1D3，這一推測(cè)是否正確還應(yīng)通過試驗(yàn)驗(yàn)證。

經(jīng)過30天培養(yǎng)，9個(gè)試驗(yàn)組愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見圖1。圖中顯示第4、8組因出現(xiàn)愈傷組織較早，獲得的愈傷組織塊較大，具有較強(qiáng)的再生能力。其次是第6、3、5、2組，各愈傷組織已經(jīng)成團(tuán)塊結(jié)構(gòu)；第7、1、9組產(chǎn)生愈傷組織較晚，愈傷組織塊較小且分散。

圖1 膝柄木葉片愈傷組織誘導(dǎo)30天試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Bhesa robusta leaf Callus induced after 30 days culture in Orthogonal test

3 討論與結(jié)論

葉片組培繁殖是對(duì)珍稀瀕危植物搶救保護(hù)的重要措施，我國(guó)特有的珍稀植物金花茶Camellia nitidissimaChi.、單種屬植物青錢柳Cyclocaryapaliurus(Bata1.)Iljinskaja的葉片組培均獲得愈傷組織[13-14]。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了膝柄木也能通過組培快繁方式實(shí)現(xiàn)種群繁殖與保護(hù)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、濃度與比例被認(rèn)為是影響愈傷組織誘導(dǎo)的重要因素。生長(zhǎng)素類2,4-D和細(xì)胞分裂素類6-BA(BAP)是葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中最常用的種類，2,4-D不但常用于葉片愈傷組織誘導(dǎo)，還對(duì)紅花黃鐘木Tabebuiarosea的子葉、下胚軸、胚根等不同類型外植體產(chǎn)生愈傷組織有促進(jìn)作用[15]。6-BA主要作用是促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)，如在野生型擬南芥葉愈傷組織誘導(dǎo)中最佳濃度為0.5 mg/L[16]，濃度過高易導(dǎo)致玻璃化。也有用于促進(jìn)萌芽，如促進(jìn)珍貴闊葉樹種刺楸Kalpanaxseptemlobus休眠芽和幼嫩莖段的腋芽萌發(fā)[17]。

唐佳佳等[18]將2,4-D+ 6-BA激素組合用于黑荊樹Acacia mearnsii葉片組織培養(yǎng)，結(jié)果表明在MS培養(yǎng)基中，6-BA 以0.5 mg/L、2,4-D 以1.5～2.0 mg/L 最 佳，MS+6-BA 0.5 mg/L +2,4-D 1.5 mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)60% 以上。在藥用百合Liliusp.鱗莖增殖組培中，MS+6-BA 0.2 mg/L+2,4-D 0.4 mg/L是最適培養(yǎng)基[19]。在玉蕊Barringtoniaracemosa葉片愈傷組織誘導(dǎo)中，MS+2,4-D 1.5mg/L +Kinetin0.5 mg/L的誘導(dǎo)率達(dá)100%[20]。山楂樹CrataegusazarolusL. var. aronia葉片在MS培養(yǎng)基中添加2,4-D 1.0 mg/L +BAP1.0 mg/L誘導(dǎo)愈傷組織最有效[21]；在MS+2,4-D 2 mg/L + BAP 0.5 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)浩浩巴樹Simmondsiachinensis葉片20～22天獲得愈傷組織[22]。這些結(jié)果與本文中的最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑比例培養(yǎng)基MS+2,4-D 1.0 mg/L +6-BA 0.5 mg/L一致。

對(duì)唇形科鼠尾草屬兩種植物Salvia officinalis和S. fruticosa的葉片組培發(fā)現(xiàn)較低的光密度(50 mmol·m-2s-1)促進(jìn)愈傷組織產(chǎn)生并誘導(dǎo)形成體細(xì)胞胚[23]。在懷山藥Dioscorea opposita葉片組培中，直接進(jìn)行光培養(yǎng)，愈傷誘導(dǎo)率只有50～55%，先暗培養(yǎng)后再光培養(yǎng)葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%，暗培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)愈傷組織產(chǎn)量越大[24]。對(duì)蘋果Maluspumila葉片組培發(fā)現(xiàn)，先暗培養(yǎng)14 d再光培養(yǎng)與先暗培養(yǎng)21 d再光培養(yǎng)葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率都達(dá)100%，采用葉片遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基比近軸面接觸培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率高約25～30%[25]。白木香Aquilariasinensis葉片組培試驗(yàn)也表明暗培養(yǎng)和葉片背面接觸培養(yǎng)基有利于愈傷組織誘導(dǎo)[26]。本文研究也認(rèn)為暗環(huán)境條件有利于誘導(dǎo)膝柄木葉片愈傷組織。

膝柄木葉片外植體背面劃痕可促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)為本文的新發(fā)現(xiàn)，在其它植物組培試驗(yàn)中尚未發(fā)現(xiàn)此類報(bào)道。主要原因是劃痕能夠增加外植體與培養(yǎng)基的有效接觸，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞分裂與增殖。

本文的研究結(jié)論是在暗培養(yǎng)時(shí)間、葉片劃痕數(shù)、2,4-D和6-BA四類因素中，暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)膝柄木葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響最大，其次為2,4-D和劃痕數(shù)，6-BA的作用不明顯。

膝柄木葉片組培誘導(dǎo)愈傷組織最佳條件是：MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，葉背劃痕數(shù)4～5條，連續(xù)暗培養(yǎng)30天。

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Study on callus induction ofBhesa robustaleaves

MO Zhu-cheng1,2, PANG Wan-wei3, LIU Jue3, LI Bin3
(1.Guangxi Mangrove Research Center,Guangxi Academy of Science, Beihai 536000, Guangxi, China; 2.Guangxi Key Lab of Mangrove Conservation, Beihai 536000, Guangxi, China; 3. Beihai Municipal Forestry Bureau, Beihai 536000, Guangxi, China)

To urgently conserve the national endangered plantBhesa robusta, a leaf tissue culture experiment under 4 factors condition of abaxial scratch, MS medium supplement with vary concentration of auxin 2,4-D andcytokinin 6-BA , dark culture period was carried on. The experiment was designed in L3(43) orthogonality experiment, 3 replicates. The results showed the ranking of factors activity to induce callus is Dark culture period ＞ 2,4-D ＞ abaxial scratch, the effect of cytokinin 6-BA is not significanctly. InB.robustaleaf tissue culture experiment, the optimum combination factors for callus induction is MS medium + 2,4-D1.0 mg/L + 6-BA0.5 mg/L, leaf abaxial scratchs = 4～5, about 30 days continuously culture in dark environment.

Bhesa robusta; leaf segments; callus; induction rate

S722.3+7

A

1673-923X(2015)10-0013-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.003

2015-04-22

中央財(cái)政林業(yè)補(bǔ)助資金項(xiàng)目（GXZC2015-G2-0021-JY）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃課題（桂科轉(zhuǎn)1346004-32）；廣西自然基金項(xiàng)目（2010GXNSFA013068）；北海市科技項(xiàng)目（北科合201203033）

莫竹承，副研究員；E-mail：mo_zhucheng@126.com

莫竹承，龐萬偉，劉 玨，等. 膝柄木葉片誘導(dǎo)愈傷組織研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015, 35(10)： 13-17, 39.

[本文編校：吳 彬]