查錢慧，譚 莎，黃永芳，洪文泓，楊亞慧，弓麗花

（華南農(nóng)業(yè)大學a.林學與風景園林學院；b.廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642）

5個油茶無性系花粉貯藏特性及雜交親和力的研究

查錢慧，譚 莎，黃永芳，洪文泓，楊亞慧，弓麗花

（華南農(nóng)業(yè)大學a.林學與風景園林學院；b.廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642）

為了研究油茶花粉貯藏特性及品系間雜交親和性規(guī)律，選取‘長林3號’、‘長林166號’、‘長林4號’、‘湘林8號’、‘岑軟3號’共5個油茶無性系花粉進行貯藏特性及人工雜交親和性研究，通過對不同貯藏條件下花粉萌發(fā)率的對比及不同雜交組合雜交座果率的統(tǒng)計與分析，發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間延長，花粉生活力呈明顯下降趨勢，油茶花粉最佳貯藏方式為冷凍干燥貯藏，‘長林3號’、‘長林166號’油茶無性系花粉冷凍貯藏90d后花粉萌發(fā)率均具45%以上，室溫干燥保存50d后花粉全部失活，低溫干燥保存90d后花粉萌發(fā)率均比冷凍干燥保存下花粉萌發(fā)率低10%左右；6個雜交組合中親和力較好的組合為：♀ 湘林8號×♂ 長林3號、♀ 長林4號×♂ 長林3號、♀ 湘林8號× ♂長林166號、♀ 長林166號×♂ 岑軟3號3月份座果率分別為40%、44%、48%、52%。

花粉生活力；花粉貯藏；座果率；雜交親和性

油茶Camellia oleifera是山茶科Theaceae山茶屬Camellia油茶組Sect. Oleifera植物，其種子提取的茶油含90%以上不飽和脂肪酸，營養(yǎng)比例合理，有“東方橄欖油”之美稱[1]。油茶良種選育旨在選育出產(chǎn)量和經(jīng)濟性狀均良好的油茶無性系。油茶育種有農(nóng)家優(yōu)良品種選育、輻射育種、雜交育種等，其中雜交育種是油茶育種重要的途徑之一[2]。

油茶雜交育種中常伴有花期不遇和遠緣雜交等問題，需要創(chuàng)造延遲花粉生活力的貯藏條件，提高雜交坐果率[3]。影響花粉生活力因素有很多，其中貯藏方式和貯藏時間對花粉生活力影響顯著[3-4]。目前已有對木犀Osmanthus fragrans、白花樹Styrax tonkinensis、垂絲紫荊cercis racemosa、野牡丹Melastoma candidum、黃瓜cucumis sativu、椰子等植物進行花粉生活力保持及貯藏特性的研究[5-10]。有關油茶花粉的研究也有報道，主要集中在對花粉形態(tài)、花粉數(shù)量、花粉管萌發(fā)、花粉生活力檢測方法等方面[11-13]，而對油茶長林系列無性系花粉貯藏特性及其雜交親和力研究尚少。本試驗選取‘長林3號’、‘長林166號’進行花粉貯藏條件和貯藏時間研究，選取 ‘長林3號’、‘長林166號’、 ‘長林4號’、‘湘林8號’、‘岑軟3號’油茶無性系共設計6個雜交組合進行人工雜交試驗，旨在為油茶花粉適宜貯藏條件探究提供理論依據(jù)，為解決油茶花期不一致和遠距離雜交提供實際參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地設在廣東省廣州市增城區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學油茶良種繁育示范基地（北緯23°24′26″，東經(jīng)113°64′16″），海拔為 85m 。屬南亞熱帶海洋性季風氣候?；貎扔筒枇譃?年生，樹高約2.8 m，冠幅約2.5 m。林地實行正常的撫育管理措施，每年冬季施肥一次，進行穴施且有機肥和化肥配合施用。

1.2 試驗材料

選取‘長林3號’、‘長林166號’油茶新鮮花粉進行貯藏條件和時間研究，選取‘長林3號’、‘長林166號’、長林4號’、‘湘林8號’、‘岑軟3號’油茶進行人工雜交親和力研究。

1.3 試驗方法

分別采集‘長林3號’、‘長林166號’2個油茶無性系待開花苞，室內室溫下培養(yǎng)至花藥裂開后搜集花粉，分裝于指形管中貼好標簽；測定2種油茶新鮮花粉的生活力，剩余分別于室溫干燥（25℃）保存、低溫干燥（4℃）保存、冷凍干燥（-20 ℃）保存，分別于貯存10 d、20 d、30 d、50 d、70 d、90 d時測定3種貯藏方式下的花粉生活力。（注： ‘岑軟3號’油茶花粉生活力已測定過且公開發(fā)表，見討論部分）

根據(jù)5個油茶無性系的優(yōu)良性狀，選擇發(fā)育正常、生長健壯的植株作為雜交親本，共設計6種親本組合：♀ 湘林8號×♂ 長林3號、♀ 湘林8號×♂ 長林166號、♀ 長林4號×♂ 長林3號、♀ 長林4號×♂ 長林166號、♀ 長林166號×♂ 岑軟3號、♀ 岑軟3號×♂ 長林166號。每個雜交組合人工授粉50朵，另選取50朵待開放花蕾標記作自然對照。人工雜交選擇在晴好天氣的早晚進行，雜交授粉的時間為2012年11月13日，授粉后立即套袋，做好標記，5d后去袋并細致管理。

1.4 試驗指標測定

花粉生活力均采用離體萌發(fā)法測定，具體方法為：配置培養(yǎng)基為0.01 %硼酸 + 0.03 %硝酸鈣+ 0.02 %硫酸鎂 + 0.01 %硝酸鉀 + 15 %蔗糖 +1 %瓊脂，將花粉置于培養(yǎng)基25℃黑暗條件下培養(yǎng)2 h以上，在10×10倍顯微鏡下檢測花粉萌發(fā)，花粉管長度大于花粉直徑視為花粉萌發(fā)，萌發(fā)率等于萌發(fā)的花粉數(shù)除以檢測的花粉總數(shù)[14]。雜交后定時記錄人工雜交和自然狀態(tài)下的座果數(shù)，并計算座果率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖由Microsoft Excel和SPSS17.0 軟件完成。

2 結果與分析

2.1 2種油茶無性系的新鮮花粉生活力

表1可知，‘長林166號’的新鮮花粉生活力為74.56%，‘長林3號’新鮮花粉生活力為67.40%。2個油茶無性系花粉生活力具顯著性差異（p＜0.05）。不同品種的新鮮花粉生活力存在差異，這可能與其遺傳物質差異有關。

表1 2種油茶的新鮮花粉生活力?Table 1 The fresh pollen viability of 2 Camellia oleifera species

2.2 不同貯藏方式和時間下2種油茶花粉生活力的變化規(guī)律

由圖1 可知，隨著貯藏時間延長，‘長林3號’油茶花粉在室溫干燥、低溫干燥及冷凍干燥條件保存，其花粉萌發(fā)率均呈下降趨勢，其中室溫干燥保存的花粉生活力下降速率最快，其在保存10 d后花粉的萌發(fā)率已經(jīng)下降到50%以下，為42.21%，在30 d后花粉失活加快，至50 d時全部失活，無法萌發(fā)；低溫干燥保存的花粉生活力下降速率居次，在保存20 d后下降到50%以下，為48.28%，保存90 d后花粉萌發(fā)率為30.87%；冷凍干燥條件保存下的花粉生活力下降速率最慢，保存10 d后花粉萌發(fā)率為61.98%，隨后花粉生活力平緩下降，在90 d后下降至45.63%。

圖1 不同貯藏條件和時間下長林3號油茶花粉生活力變化Fig.1 The diversification of pollen viability about ‘Changlin 3’ in different storage conditions at different times

由圖2可知，隨著貯藏時間延長，‘長林166號’花粉在室溫干燥、低溫干燥及冷凍干燥條件保存，其花粉生活力均呈下降趨勢。3種貯藏條件下花粉萌發(fā)率下降速率從高到低為：室溫干燥保存＞低溫干燥保存＞冷凍干燥保存。室溫干燥保存的花粉隨著時間的增加其萌發(fā)率迅速下降，在50 d后花粉萌發(fā)率下降至0%；低溫干燥和冷凍干燥保存的花粉萌發(fā)率下降速率相差不大 ，在保存10 d后花粉的萌發(fā)率分別為63.03%和68.48%，保存90 d后花粉萌發(fā)率分別下降至42.75%和47.73%。

圖2 不同貯藏條件和時間下長林166號油茶花粉生活力變化Fig 2 The diversification of pollen viability about ‘Changlin 166’ in different storge conditions at different times

2.3 人工雜交坐果率與雜交親和性分析

由表2 知，在人工雜交和自然雜交中，6個油茶雜交組合3月份坐果率相比1月份均有下降，這與油茶花期雨水過多，傳粉受阻有關。1月份6個油茶雜交組合的人工授粉座果率均低于自然狀態(tài)下座果率，其中座果率相差最大的為♀ 岑軟3號×♂ 長林166號，其人工授粉座果率為50%，自然授粉座果率為96%，二者相差46%；座果率相差最小的為♀ 湘林8號×♂ 長林166號，其人工授粉座果率為74%，自然授粉座果率為76%，二者相差2%。3月份♀ 湘林8號×♂長林3號的人工座果率高于自然授粉坐果率，分別為40%和32%；其余5個油茶雜交組合的人工雜交坐果率均低于自然授粉座果率；其中3月份人工授粉座果率最高的是♀ 長林166號×♂ 岑軟3號，為52%。自然授粉座果率最高的為♀ 岑軟3號×♂ 長林166號，為94%。

表2 人工雜交與自然雜交的座果率Table 2 The fruit-set rate of artificial and natural hybridization

♀ 湘林8號×♂ 長林3號3月份人工授粉座果率比♀ 湘林8號×♂ 長林166號低8%，表明 湘林8號與 長林166號雜交親和性較高；♀ 長林4號×♂ 長林3號3月份人工授粉座果率比♀ 長林4號×♂ 長林166號高4%，表明‘長林4號‘與‘長林3號’雜交親和性較高；♀ 湘林8號×♂ 長林3號3月份人工授粉座果率比♀ 長林4號×♂ 長林3號低4%，表明 長林4號與 長林3號雜交親和性較高；♀ 湘林8號×♂ 長林166號、♀ 長林4號×♂ 長林166號和♀ 岑軟3號×♂ 長林166號3月份人工授粉座果率分別為48%、40%、42%，3個母本與‘長林166號’雜交親和性大小為：‘湘林8號’＞ ‘岑軟3號’＞ ‘長林4號’。 ‘長林166號’與‘岑軟3號’的人工授粉正反交組合中，正交座果率均高于反交組合，表明正交雜交親和性更好；正反交自然授粉在1月份和3月份的座果率均高于人工雜交座果率，♀ ‘岑軟3號’×♂ ‘長林166號’雜交組合在1月和3月的座果率分別為96%和94%，表明 ‘岑軟3號’作為母本，自然授粉良好，前期落果少。

3 結論與討論

李春林等[15]對長林系列油茶活體授粉和離體培養(yǎng)下花粉管萌發(fā)進行了比較，表明活體萌發(fā)快于離體培養(yǎng)萌發(fā)，本試驗對長林系列油茶進行了貯藏特性研究。本試驗結果表明，‘長林3號’和‘長林166號’油茶無性系花粉在不同貯藏條件下，花粉生活力差異較大，隨貯藏時間延長，花粉生活力呈明顯下降趨勢；室溫干燥下貯藏花粉生活力下降最快，2個油茶無性系花粉貯藏50 d全部失活，低溫干燥條件下貯藏的花粉生活力下降緩慢，冷凍干燥貯藏的下降速率最慢。許林等研究表明貯藏溫度低有利于花粉生活力的保存，4℃和-20℃下茶樹花粉可保存4個月以上，本試驗的2個油茶無性系花粉在冷凍干燥貯藏90 d 后仍有生活力，與其研究結果基本一致[16]。楊志玲等研究發(fā)現(xiàn)紅山茶組花粉冷凍密封貯藏（-18℃）1 a后花粉萌發(fā)率仍有34.83%[17]，而本試驗研究發(fā)現(xiàn)‘長林3號’、‘長林166號’2種油茶花粉在冷凍干燥貯藏90d 后均有45%以上的萌發(fā)率，與其研究結果基本一致且同一貯藏條件下長林系列花粉更耐貯藏。黃永芳等研究表明‘岑軟3號’油茶新鮮花粉的生活力為78.0%，其花粉貯藏特性規(guī)律表現(xiàn)為室內干燥貯藏下花粉生活力下降最快，低溫干燥保存下花粉生活力下降速度慢于室內干燥保存下，冷凍干燥下花粉生活力下降速度最慢[18]，岑軟3號油茶花粉貯藏特性與‘長林3號’、‘長林166號’相似。Diana等研究也表明冷凍干燥是保存花粉的良好方法之一[19]。袁德義等研究表明攸縣油茶和黃蛋紅花茶花粉在-20℃貯藏條件下生活力明顯低于4℃、25℃和室溫條件，本試驗與其結果相差很大，可能是各自研究材料間特性不一以及各自試驗條件有所差異[20]?！L林3號’、‘長林166號’油茶無性系在同一貯藏時間及條件下花粉萌發(fā)率存在差異，表明不同品種的油茶花粉生活力存在差異[21]?；ǚ凵盍χ饕c遺傳物質相關，同時花粉營養(yǎng)物質有限，呼吸消耗會導致其生活力逐漸下降，因此貯藏時需要放入硅膠進行干燥保存，減緩呼吸作用[22-23]。

通過6種雜交組合的親和力對比，發(fā)現(xiàn)親和力較好的組合是♀ 湘林8號×♂長林3號、♀長林4號×♂長林3號、♀湘林8號× 長林166號♂。比較幾種雜交組合，發(fā)現(xiàn)‘湘林8號’作為母本時座果率較高，可以作為雜交母本材料。♀岑軟3號×♂長林166號3月份自然授粉座果率高達94%，顯著高于雜交授粉座果率，可能是‘岑軟3號’作為母本自然授粉良好特性有關，同時也可能是人工雜交操作不當導致雜交座果率過低，另外雜交時空氣濕度也是影響因素之一。6個雜交組合3月份座果率相對1月份均有下降，可能是因為期間風雨天氣導致油茶落果較嚴重。雜交座果率受多方面因素的影響，除了氣候因素外，親本間雜交不親和性以及樹體生長旺盛期過多消耗營養(yǎng)是因素之一[24]。此外，人為操作的不當、授粉期間降雨過多或氣溫低抑制花粉正常萌發(fā)伸長影響受孕等，都會導致油茶座果率下降[25]。

油茶生殖生長中存在自交不親和性以及種間雜交不親和性，進行花蕾期授粉是解決這一問題的重要手段[26-28]。本試驗通過研究‘長林3號’、‘長林166號’油茶無性系花粉的貯藏特性以及6個雜交組合親和性研究，分析了油茶無性系花粉貯藏最佳條件及其親本間雜交親和性，為油茶花粉保存提供方法和指導，為油茶遠距離及花期不一雜交提供理論依據(jù)及品種的配置給予應用指導。

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The Research about the storage characteristic of pollen and artificial hybridization affinity about five kinds ofCamellia oleiferaclones

ZHA Qian-hui, TAN Sha, HUANG Yong-fang, HONG Wen-hong, YANG Ya-hui, GONG Li-hua
(a. College of Forestry and Landscape Architecture; b.Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China )

To investigate the storage characteristic of pollen and artificial hybridization affinity about five kinds ofCamellia oleifera. 5Camellia oleiferaspecies which consisted of ‘Changlin 3’, ‘Changlin 166’, ‘Changlin 4’, ‘Xianglin 8’ and ‘Cenruan 3’ were aimed to examine the effects of different storage condition on pollen germination and the artificial hybridization affinity. Through the contrast of pollen germination rate in different storage conditions and the statistics and analysis of hybrid fruit-set rate of different hybridized combinations, it indicated that the longer the storage time is, the lower the pollen viability will be. It also showed that the freeze-dried was the best storage method ofCamellia oleiferapollen. The pollen germination rates of ‘Changlin 3’ and ‘Changlin 166’,Camellia oleiferapollen were all more than 45% after 90 days’ freeze-dried storage and all the pollen lost viability after 50 days’ dry storage at room temperature. After 90 days of cold-dried storage, the pollen germination rate was about 10% less than in freeze-dried storage.Among the six hybridized combinations, there were four combinations with good affinity. They were ♀ Xianglin 8× ♂ Changlin 3, ♀Changlin 4× ♂ Changlin 3, ♀ Xianglin 8× ♂ Canglin 166, ♀ Changlin 166× ♂ Cenruan 3. And the fruit set percentages of the four combinations in March were 40%, 44%, 48%, 52% respectively.

pollen viability; pollen storage; fruit-set rate; artificial hybridization affinity

S727.3；S794.4

A

1673-923X(2015)10-0079-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.014

2014-02-10

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（2013KJCX009－05,2011KJCX014－01）

查錢慧，碩士研究生

黃永芳，教授；E-mail：hyfang@scau.edu.cn

查錢慧，譚 莎，黃永芳，等. 5個油茶無性系花粉貯藏特性及雜交親和力的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報，2015,35(10)： 79-82, 108.

[本文編校：吳 彬]