王 瑞 ，陳永忠 ，王湘南 ，彭邵鋒 ，陳隆升 ，馬 力 ，羅 健 ，楊小胡

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

油茶組培苗高效增殖體系的建立

王 瑞1，2，3，陳永忠2，3，王湘南2，3，彭邵鋒2，3，陳隆升2，3，馬 力2，3，羅 健2，3，楊小胡2，3

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

以油茶優(yōu)良無(wú)性系“湘林1號(hào)”的莖段為外植體培養(yǎng)的無(wú)菌苗為材料，開(kāi)展了無(wú)菌苗增殖培養(yǎng)研究，研究結(jié)果表明：基本培養(yǎng)基及外源激素均對(duì)油茶無(wú)菌苗增殖培養(yǎng)產(chǎn)生重要作用，以WPM為基本培養(yǎng)基，激素組合為6-BA5.0 mg/L+NAA0.01 mg/L+生物素1.0 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)最高值3.90；以MS為基本培養(yǎng)基，激素組合為6-BA1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L +生物素0.5 mg/L 時(shí)，新梢生長(zhǎng)量達(dá)2.01 cm。

油茶；優(yōu)良無(wú)性系；組織培養(yǎng)；增殖體系

油茶Camellia oleifera是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種，與油棕、油橄欖和椰子并稱(chēng)為世界四大木本食用油料樹(shù)種，湖南、江西、廣西等省區(qū)是其主要集中產(chǎn)區(qū)。油茶的主要產(chǎn)品茶油不飽和脂肪酸高達(dá)90%左右，富含脂溶性VA、VE、VK，可預(yù)防心血管硬化，降血壓，降血脂等，是一種理想的營(yíng)養(yǎng)保健食用油[1]。此外，茶油還被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥、化妝業(yè)領(lǐng)域中，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

我國(guó)的油茶種植歷史悠久，在選擇育種、良種繁育、豐產(chǎn)栽培、加工利用等方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)和取得重大進(jìn)展，但在油茶組織培養(yǎng)方面的研究起步較晚，從20世紀(jì)80年代開(kāi)始有學(xué)者對(duì)油茶組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，但進(jìn)展緩慢，一直未獲得生根較好的苗木[2-6]。而組織培養(yǎng)對(duì)油茶優(yōu)良種質(zhì)資源和性狀的保存、生物技術(shù)育種有著深遠(yuǎn)而重大的意義，對(duì)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也將產(chǎn)生重要影響。筆者以“湘林”系列油茶優(yōu)良無(wú)性系為材料，開(kāi)展了油茶組培苗叢生芽增殖體系的研究，為油茶植株再生體系的建設(shè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料來(lái)自湖南省林業(yè)科學(xué)院國(guó)家級(jí)油茶種質(zhì)資源收集保存庫(kù)（國(guó)家林業(yè)局油茶研究開(kāi)發(fā)中心試驗(yàn)基地），為油茶優(yōu)良無(wú)性系“湘林1號(hào)”優(yōu)樹(shù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體采集

于2008年4月，采集長(zhǎng)10～25 cm的油茶枝條帶回實(shí)驗(yàn)室，將莖段剪切成帶1～2個(gè)腋芽、長(zhǎng)約1.5～2.0 cm的小段，用流水沖洗干凈后用中性洗衣粉水輕洗枝條，置于流水下沖洗2～3 h。

1.2.2 無(wú)菌苗的獲得

將沖洗后的外植體置無(wú)菌超凈臺(tái)上，先用75%酒精快速滅菌10 s，然后用無(wú)菌水沖洗3次，接著用0.1%HgCl2消毒2 min，用無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%HgCl2消毒3 min，最后用無(wú)菌水沖洗5次后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基WPM+6-BA1.0 mg/L+IBA0.5 mg/L+蔗糖20 mg/L+瓊脂7 mg/L上培養(yǎng)后獲得無(wú)菌苗。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)L9（34），選用了3種不同的基本培養(yǎng)基MS、WPM、B5，附加不同濃度的6-芐氨基腺呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、生物素，正交設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)表Table 1 Orthogonal experiment table

1.2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中蔗糖3.0%，瓊脂7 g/L。培養(yǎng)基用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.2，在恒溫120℃和恒壓1.1個(gè)大氣壓下消毒滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度（25±3）℃，光照時(shí)間12 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有處理都進(jìn)行3次重復(fù)，采用SAS9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基、外源激素種類(lèi)及濃度對(duì)苗木增殖系數(shù)的影響

方差分析結(jié)果可以看出，總效應(yīng)、基本培養(yǎng)基類(lèi)型和生物素濃度的效應(yīng)均達(dá)到0.01顯著水平，6-BA濃度的效應(yīng)達(dá)到0.05顯著水平，NAA濃度的效應(yīng)沒(méi)有達(dá)到顯著水平，說(shuō)明基本培養(yǎng)基類(lèi)型和生物素的濃度對(duì)油茶組培苗增殖系數(shù)的影響極大，6-BA的濃度對(duì)油茶組培苗增殖系數(shù)的有一定的影響，而NAA則影響不大。

表2 不同處理對(duì)增殖系數(shù)影響方差分析表Table 2 Variance analysis table of influence of different treatment on multiplication coefficient

表3 各因素對(duì)增殖系數(shù)影響方差分析表Table 3 Variance analysis table of influence of different factors on multiplication coefficient

表4 基本培養(yǎng)基、外源激素對(duì)增殖系數(shù)的影響?Table 4 Influence of basic medium and hormone on multiplication coefficient

基本培養(yǎng)基：從表4可以看出，3種不同的基本培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基）對(duì)油茶組培苗增殖的影響存在極顯著差異（p＜0.01），多重比較表明，WPM培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基分別存在顯著差異，而MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基之間不存在顯著差異，其中以 WPM培養(yǎng)基的增殖效果最好，三種不同培養(yǎng)基的平均增殖系數(shù)為：WPM培養(yǎng)基（2.94）＞MS培養(yǎng)基（1.53）＞ B5培養(yǎng)基（1.42）。

細(xì)胞分裂素（6-BA）：細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)繼代過(guò)程中起關(guān)鍵作用，細(xì)胞分裂素濃度的高低直接影響增值系數(shù)，試驗(yàn)選用細(xì)胞分裂素（6-BA），設(shè)計(jì)了3種不同的的濃度（1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L），結(jié)果表明不同的6-BA濃度對(duì)油茶組培苗增殖的影響存在顯著差異。多重比較表明，1.0 mg/L與3.0 mg/L、5.0 mg/L間分別存在顯著差異，而3.0 mg/L、5.0 mg/L間不存在顯著差異，說(shuō)明細(xì)胞分裂素6-BA的濃度對(duì)油茶組培苗增殖系數(shù)的影響顯著，并且隨6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)增大，所以較高濃度的細(xì)胞分裂素有利于提高油茶繼代苗的增殖系數(shù)，本試驗(yàn)中，細(xì)胞分裂素（6-BA）的濃度以5.0 mg/L為最佳。

生長(zhǎng)素（NAA）：試驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種不同的生長(zhǎng)素（NAA）的濃度（0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L），從方差分析結(jié)果可以看出，3種不同的濃度間均不存在顯著差異，說(shuō)明生長(zhǎng)素NAA的濃度對(duì)增殖系數(shù)沒(méi)有顯著影響。

生物素：對(duì)不同的生物素濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響效果進(jìn)行顯著性分析表明：不同濃度的生物素對(duì)油茶組培苗增殖的影響存在極顯著差異，1.0 mg/L與0.5 mg/L、1.5 mg/L間分別存在顯著差異，而0.5 mg/L、1.5 mg/L間不存在顯著差異，本試驗(yàn)中，以生物素濃度為1 mg/L效果最好，濃度過(guò)高或過(guò)低都不能促進(jìn)其增殖系數(shù)的增加，增殖系數(shù)反而受抑制。

綜合單因素分析結(jié)果，在油茶增殖培養(yǎng)階段，以WPM培養(yǎng)基、6-BA 5.0 mg/L、生物素1.0 mg/L為最佳，即6號(hào)處理，增殖系數(shù)高達(dá)3.90。

圖1 油茶芽苗在6號(hào)處理上的生長(zhǎng)情況Fig.1 The growth of tissue culture seedlings on treatment 6

2.2 基本培養(yǎng)基及植物激素對(duì)苗木生長(zhǎng)量的影響

油茶組培苗的高度和質(zhì)量是決定組培苗是否生根的關(guān)鍵因素，而組培苗的生長(zhǎng)速度（以相同時(shí)間內(nèi)組培苗的凈生長(zhǎng)量來(lái)衡量，本文中稱(chēng)“苗高”）又決定了培養(yǎng)周期的長(zhǎng)短，研究了基本培養(yǎng)基、外源激素種類(lèi)及濃度對(duì)苗高的影響。

表5 不同處理對(duì)苗高影響方差分析表Table 5 Variance analysis table of influence of different treatment on seedling height

表6 各因素對(duì)苗高影響方差分析表Table 6 Variance analysis table of influence of different factors on seedling height

方差分析結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基、激素類(lèi)型及激素濃度對(duì)油茶繼代苗苗高的影響均達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明基本培養(yǎng)基、激素類(lèi)型及激素濃度對(duì)油茶組培苗苗高影響很大。

基本培養(yǎng)基：對(duì)不同基本培養(yǎng)基對(duì)苗高影響效果進(jìn)行顯著性分析表明：3種不同培養(yǎng)基間均存在極顯著差異，說(shuō)明基本培養(yǎng)基對(duì)繼代培養(yǎng)過(guò)程中的油茶組培苗苗高影響顯著，以MS培養(yǎng)基效果最好。

細(xì)胞分裂素（6-BA）：由表7可以看出，不同的6-BA濃度對(duì)油茶組培苗苗高的影響存在極顯著差異，5.0 mg/L與1.0 mg/L、3.0 mg/L間分別存在顯著差異，而1.0 mg/L、3.0 mg/L間不存在顯著差異（見(jiàn)表7），說(shuō)明不同濃度的6-BA對(duì)苗高的影響差異顯著，以濃度為1.0 mg/L效果最好，濃度的提高，并不能促進(jìn)其苗高的增加。

生長(zhǎng)素（NAA）：生長(zhǎng)素的主要生理作用是促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)，若選擇的激素種類(lèi)及濃度合適，可以有效的促進(jìn)植株生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)中選用最常用的萘乙酸（NAA），從方差分析結(jié)果可以看出，3種不同濃度的生長(zhǎng)素NAA對(duì)組培苗苗高的影響均存在極顯著差異，說(shuō)明不同濃度的NAA對(duì)苗高的影響差異顯著，以濃度為0.01 mg/L效果最好，濃度的提高，并不能促進(jìn)其高度的增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.1 mg/L時(shí)反而受抑制。

表7 基本培養(yǎng)基、外源激素對(duì)苗高的影響?Table 7 Influence of basic medium and hormone on seedling height

生物素：經(jīng)方差檢驗(yàn)結(jié)果表明：不同的生物素濃度對(duì)油茶組培苗苗高的影響存在極顯著差異，1.5 mg/L與0.5 mg/L、1.0 mg/L間分別存在極顯著差異，而0.5 mg/L、1.0 mg/L間不存在顯著差異，說(shuō)明生物素濃度對(duì)油茶組培苗苗高影響顯著，以生物素濃度為0.5 mg/L效果最好，濃度的提高，并不能促進(jìn)其苗高的增加，當(dāng)濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí)反而受抑制。

綜合單因素分析結(jié)果，以MS培養(yǎng)基、6-BA 1.0 mg/L、NAA0.01 mg/L、生物素0.5 mg/L為最佳，即1號(hào)處理，苗木凈生長(zhǎng)量為2.01 cm。

圖2 油茶芽苗在1號(hào)處理上的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of tissue culture seedlings on treatment No.1

3 結(jié)論與討論

（1）基本培養(yǎng)基對(duì)油茶組織培養(yǎng)影響很大。研究結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基對(duì)油茶組織培養(yǎng)影響較大，不同的基本培養(yǎng)基適合于油茶組織培養(yǎng)的不同階段，WPM培養(yǎng)基有利于苗木的增殖，MS培養(yǎng)基有利于組培苗新梢的生長(zhǎng)，這與譚文澄等提到的“山茶屬對(duì)培養(yǎng)基的要求不太嚴(yán)格”不一致[7]。

（2）外源激素對(duì)增殖系數(shù)的影響。細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素分別控制細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的分裂，從而影響組培苗的增殖，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素均為重要因子，但研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素的濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響存在極顯著差異，并且細(xì)胞分裂素濃度越高，增殖系數(shù)越大，而生長(zhǎng)素的濃度對(duì)增殖系數(shù)的影響無(wú)顯著差異，說(shuō)明在油茶組培苗增殖過(guò)程中，細(xì)胞分裂素的作用大于生長(zhǎng)素。這是因?yàn)椋环矫?，?xì)胞分裂素促進(jìn)了內(nèi)源生長(zhǎng)素的合成，從而對(duì)外源生長(zhǎng)素的需求量減少；另一方面，幼嫩的組織自身能夠合成部分生長(zhǎng)素，這也許是造成外源細(xì)胞分裂素相對(duì)重要的原因。研究結(jié)果表明，激素組合以6-BA 5.0 mg/L+NAA0.01 mg/L +生物素1.0 mg/L為最佳組合，增殖系數(shù)高達(dá)3.90。

（3）外源激素對(duì)苗高的影響。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素及生長(zhǎng)素的濃度對(duì)苗高的影響均存在極顯著差異，并且濃度越低，新梢生長(zhǎng)量越大，說(shuō)明細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素均發(fā)揮重要作用，只有兩者交互作用，才能促進(jìn)新梢的生長(zhǎng)。研究結(jié)果表明，激素組合以6-BA 1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L+生物素0.5 mg/L為最佳組合，苗木凈生長(zhǎng)量達(dá)2.01 cm。

[1]陳永忠,王德斌.湖南省油茶良種選育及推廣應(yīng)用概況[J].湖南林業(yè)科技,2001,28(3)：23-27.

[2]陳永忠,楊小胡,彭邵鋒,等.我國(guó)油茶良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā),2005,19(4)：1-4.

[3]畢方鋮,譚曉風(fēng),張智俊,等.油茶離體培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株的研究[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2004,22(2)：5-9.

[4]丁植磊,張日清,劉友全,等.油茶12個(gè)物種花藥愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2007,25(1)：20-24.

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[6]李建安,張日清,石明旺,等.油茶兩物種花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2003,21(3)：36-38.

[7]譚文澄,戴策剛. 觀(guān)賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社,1998.

Establishment of High Efficient Propagation System of Tissue Culture Seedling of Camellia oleifera

WANG Rui1,2,3, CHEN Yong-zhong2,3, WANG Xiang-nan2,3, PENG Shao-feng2,3, CHRN Long-sheng2,3, MA Li2,3, LUO Jian2,3, YANG Xiao-hu2,3
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China; 3. National Oil-tea Camellia Engineering & Technology Research Center, Changsha 410004, Hunan, China)

Sterile seedlings ofCamellia oleiferasuperior clones “XL1”, which induced from stem segments,were taking as materials,and proliferation culture were studied. The results showed that： basic medium and exogenous hormones played important roles in proliferation culture, the shoots were subcultured and multiplied on WPM medium containing 5.0 mg/L 6-BA, 0.01 mg/L NAA and 1.0 mg/L biotin, and proliferation coefficient reached 3.90; the young sprout of seedlings grew rapidly on MS medium containing 1.0 mg/L 6-BA, 0.01 mg/L NAA and 0.5mg/L biotin,which reached 2.01 cm.

Camellia oleifera;superior clones;tissue culture; proliferation

S727.3；S794.4

A

1673-923X(2015)10-0040-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.007

2014-02-10

湖南省科技重大專(zhuān)項(xiàng)“油茶良種繁育與生態(tài)高效培育關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（2013FJ1006）

王 瑞，博士研究生，助理研究員

陳永忠，博士，研究員；E-mail：chenyongzhong06@163.com

王 瑞，陳永忠，王湘南，等. 油茶組培苗高效增殖體系的建立[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015, 35(10)： 40-43.

[本文編校：吳 彬]