索化夷，趙 欣，騫 宇，陳 娟，李 鍵，張 玉，闞建全,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；4.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041）

永川毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中微生物總量與區(qū)系變化規(guī)律

索化夷1,2，趙 欣3，騫 宇3，陳 娟4，李 鍵4，張 玉1,2，闞建全1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；4.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041）

采用巢式聚合酶鏈式反應(yīng)配合變性梯度凝膠電泳技術(shù)對永川豆豉發(fā)酵過程中微生物區(qū)系生態(tài)演化進行解析。結(jié)果表明：永川豆豉在制曲過程中霉菌和細菌呈對數(shù)增長，進入后發(fā)酵階段菌落總數(shù)快速下降，并保持在較低水平。永川豆豉在制曲前期有多種乳酸菌生長，后期乳酸菌受霉菌增長抑制，種類減少。在后發(fā)酵階段奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odysseyi）、乳酸桿菌（Lactobacillus oligofermentans）和乳酸桿菌（Lactobacillus lindneri）是優(yōu)勢菌群。同時在制曲初期也發(fā)現(xiàn)了費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）等雜菌生長。永川豆豉制曲階段優(yōu)勢霉菌是總狀毛霉（Mucor racemosus），同時伴有有性根霉（Rhizopus sexualis）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、大孢聯(lián)軛霉（Syzygites megalocarpus）、米根霉（Rhizopus oryzae）的生長，后發(fā)酵階段有接合酵母（Zygosaccharomyces sp.）的參與。

永川豆豉；微生物區(qū)系；巢式聚合酶鏈式反應(yīng)；變性梯度凝膠電泳

傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品生產(chǎn)是一個極為復(fù)雜、由多種微生物參與的發(fā)酵過程。微生態(tài)菌群的構(gòu)成及演化決定了大豆發(fā)酵食品發(fā)酵過程中各類酶系的活性。蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等酶活性決定了蛋白質(zhì)、粗纖維、淀粉、脂肪等降解速度，而這一切決定了大豆發(fā)酵食品的色澤變化、質(zhì)構(gòu)變化、風味形成。因此，發(fā)酵食品中微生物的區(qū)系一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究重點[1-3]。永川傳統(tǒng)毛霉型采用的是自然開放制曲，參與發(fā)酵微生物較多。由于無法控制制曲微生物，存在病原菌參與的可能。到目前為止，已經(jīng)在大豆發(fā)酵食品中檢測到了腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、傘枝犁頭霉（Absidia corymbifera）、糞腸球菌（Enterococcus faecium）和微球菌（Micrococcus）等[4-5]多種有害微生物。因此對于永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的分析非常重要，這不但有利于發(fā)酵菌株的標準化，也有利于發(fā)酵的安全控制。目前有關(guān)毛霉型豆豉微生物區(qū)系的研究還未見報道。

傳統(tǒng)微生物分離手段主要是利用不同培養(yǎng)基來分離鑒定發(fā)酵微生物，但這種方法僅能對主體微生物進行簡單分析[6-9]，無法滿足復(fù)雜微生物區(qū)系的分析，不能對所有參與菌群進行確認。隨著變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)發(fā)展，對于復(fù)雜區(qū)系的微生物研究出現(xiàn)了改觀。目前聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術(shù)已普遍應(yīng)用于發(fā)酵食品的微生態(tài)研究。Chen Tingtao 等[10]對曲霉型豆豉制曲過程中微生物區(qū)系變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、淀粉畢赤酵母（Pichia farinose）等多種微生物參與發(fā)酵。Kim等[4]利用該技術(shù)對家庭制作和工廠生產(chǎn)韓國大醬的微生物區(qū)系進行了分析，發(fā)現(xiàn)它們之間微生物構(gòu)成無明顯差異。Porcellato等[11]對自然發(fā)酵酸乳微生態(tài)進行研究，檢測到了多種乳酸菌。Thanh等[12]研究了越南一種傳統(tǒng)酒發(fā)酵初始微生物區(qū)系。這些研究都取得了比傳統(tǒng)方法更豐富的微生物信息。

本實驗采用巢式PCR（nested-PCR）配合DGGE技術(shù)對永川豆豉發(fā)酵過程中微生物區(qū)系生態(tài)演化進行分析，客觀地評價微生物種類、數(shù)量及優(yōu)勢菌群的變化規(guī)律，闡明永川豆豉成熟過程中微生物發(fā)揮的功能作用，以期為永川毛霉型豆豉發(fā)酵標準化和安全控制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

永川毛霉型豆豉由永川豆豉食品有限公司提供，取經(jīng)天然制曲發(fā)酵，處于不同發(fā)酵階段的樣品。原料大豆產(chǎn)地吉林省。永川毛霉型豆豉基本生產(chǎn)工藝流程：大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸料→冷卻→自然發(fā)酵制曲→翻曲→拌和（食鹽含量13～14 g/100 g、白酒、醪糟）→入罐發(fā)酵后熟→成品。

樣本采集后，微生物總數(shù)測試樣本用冰袋保藏，到實驗室立即檢測，S1～S16分別代表了不同發(fā)酵時期的永川毛霉型豆豉樣品。詳見表1。

表1 實驗樣品的編號Table 1 Codes of different experimental samples

由于在微生物區(qū)系研究中對制曲過程采樣密集，微生物區(qū)系研究樣本代號及代號含義見表2。各樣本采集后用冰袋保存，到實驗室后立即進行總DNA提取。

表2 微生物區(qū)系實驗樣品代號及其代號含義Table 2 Defi nitions of different experimental samples

1.2 試劑

土壤DNA小量提取試劑盒 美國Omega公司；四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、Tris、過硫酸銨、尿素 美國Sigma公司；瓊脂糖西班牙Gene公司；50×TAE、甘油、LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂 北京索萊寶生物科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國Genview公司；T4連接試劑盒、Top10感受態(tài)細胞 北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

變性梯度凝膠電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；G:Box EF凝膠成像系統(tǒng) 美國Syngene公司；WH-1微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；H-2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；JH-722分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；THED臺式恒溫振蕩器 太倉市實驗設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物總量變化研究

豆豉發(fā)酵過程中細菌數(shù)量變化的測定，根據(jù)GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》標準進行測定[13]；豆豉霉菌和酵母菌數(shù)量變化的測定，根據(jù)GB 4789.15-2010《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》進行測定[14]。

1.4.2 永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物基因組DNA提取

取5～6 g永川毛霉型豆豉樣品放入研缽中，加入約占研缽體積2/3的液氮，立即在液氮中充分研磨豆豉直至細粉狀（加入液氮3～5 次），稱取50～100 mg豆豉樣品，按提取試劑盒說明書中提供的方法進行后續(xù)操作。

1.4.3 16S rRNA V3區(qū)和18S rRNA的巢式PCR擴增

對豆豉宏基因組DNA采用巢式PCR技術(shù)進行兩次擴增，相比較普通PCR方法，一方面增加擴增靈敏度，可以將痕量微生物檢測到，另一方面可以減少非特異性擴增，增加PCR反應(yīng)特異性。

1.4.3.1 永川毛霉型豆豉細菌16S rRNA V3區(qū)的巢式PCR擴增

細菌基因組16S rRNA V3區(qū)PCR擴增：以提取所得的宏基因組DNA為模板，用16S rRNA V3區(qū)通用正向引物[4,13]27f（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和反向引物1492r（5’-GGC TAC CTT GTT ACG GAC TT-3’）進行擴增。25 μL反應(yīng)體系：1 μL模板、引物各0.5 μL、2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+）、2 μL dNTP、0.25 μL Taq DNA聚合酶、18.25 μL滅菌超純水。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，作為巢式PCR的模板。

細菌巢式PCR：以上面PCR產(chǎn)物作為模板，用引物338f[4]（5’-ACT CCA CGG GAG GCA GCA G-3’）及518r （5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’），并在引物338f 的5’末端加上40 bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GC G GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G）[15]，進行擴增。50 μL反應(yīng)體系：2 μL模板、引物各1 μL、5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+）、4 μL dNTP、0.5 μL Taq DNA聚合酶、36.5 μL滅菌超純水。采用降落PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，65～55 ℃ 30 s（每個循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃ 30 s，20 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，8 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.2 真菌18S rRNA的巢式PCR擴增

第一次PCR擴增：以所得的宏基因組DNA為模板，用18S rRNA通用正向引物NS1（F）[16-17]（5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C -3’）及FR1（R）（5’-AIC CAT TCA ATC GGT AIT -3’）進行擴增。25 μL反應(yīng)體系：1 μL模板、引物各0.5 μL、2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+）、2 μL dNTP（2.5 mmol/L）、0.25 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、18.25 μL滅菌超純水。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫鳛槌彩絇CR的模板。

真菌巢式PCR：以第一次PCR產(chǎn)物作為模板，用引物FF390（F）[16]（5’-CGATAACGAACGAGACCT-3’）及FR1（R）+（5’-AIC CAT TCA ATC GGT AIT-3’），并在引物FR1（R）+的5’末端加上40 bp的GC夾子（C GC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG G CA CGG GGG G），進行擴增。50 μL反應(yīng)體系：2 μL模板、引物各1 μL、5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+）、4 μL dNTP、0.5 μL Taq DNA聚合酶、36.5 μL滅菌超純水。采用降落PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，65～55 ℃ 30 s（每個循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃ 30 s，20 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，8 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.3 DGGE分析

參照朱揚玲[18]的方法，采用Bio-Rad公司的DcodeTM通用突變檢測系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物進行電泳分離分析。

分別取不同樣品的巢式PCR擴增產(chǎn)物30 μL與6 μL 6×Loading Buffer混合后加入到點樣孔中，采用8%丙烯酰胺（丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量比為19∶1）變性凝膠，30%～60%變性劑，在1×TAE緩沖液中，恒溫60 ℃、恒壓100 V條件下電泳6 h。電泳結(jié)束后取出膠放入200 mL DGGE染液中搖蕩浸染40 min，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

用無菌手術(shù)刀切下特征條帶。分別放入無菌2 mL離心管中，用槍頭搗碎凝膠，加入50 μL滅菌超純水，4 ℃放置過夜，取上清液作為模板，分別以不帶GC夾的細菌和真菌的引物對回收DNA進行擴增，反應(yīng)體系及程序分別與細菌和真菌巢式PCR一致。擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，作為克隆模板?/p>

1.4.4 克隆測序

采用北京天根生化科技有限公司的pGM-T Vector克隆試劑盒，方法參照試劑盒說明書。采用北京索萊寶科技有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，方法參照試劑盒說明書。以提取所得質(zhì)粒DNA作為模板，用引物采用對應(yīng)的細菌和真菌不帶GC夾子的巢式PCR引物程序進行擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

提取得到的質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并在GenBank比對基因序列，檢索相關(guān)微生物。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各樣本DGGE譜帶得到的微生物區(qū)系數(shù)據(jù)矩陣用NTSYSpc2.1軟件進一步進行分析，相似性系數(shù)采用Dice系數(shù)，非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析。其他數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化

2.1.1 霉菌數(shù)量的變化

圖1 豆豉發(fā)酵過程中霉菌數(shù)量的變化Fig.1 Growth curve of mould in Douchi during different fermentation stages

由圖1可知，永川毛霉型豆豉在制曲前期（S4～S6）數(shù)量較少，從S6開始生長旺盛。霉菌總數(shù)從S6的1.32×106CFU/g上升到制曲結(jié)束（S9）的1.760×109CFU/g，達到最大值。制曲在菌房中進行，環(huán)境溫度、相對濕度等條件對霉菌生長非常適合，所以在制曲期間霉菌數(shù)量呈幾何級數(shù)增長。在豆豉曲坯經(jīng)過拌料進入后發(fā)酵階段后（S10），由于拌和了13%～14%的食鹽、醪糟、白酒等拌料，高濃度的食鹽含量降低了豆豉的水分活度，微生物生長受到抑制，數(shù)量迅速下降。同時白酒對微生物有殺滅作用。進入后發(fā)酵階段，是一個密閉高鹽的環(huán)境，好氧菌無法生存。但一些厭氧耐鹽的霉菌逐漸適應(yīng)生長環(huán)境，在后發(fā)酵第75天（S13）出現(xiàn)了一個小生長高峰，不過隨著大量次生代謝產(chǎn)物的增加和酸度的提高而逐漸下降。霉菌的生長狀況與毛霉型豆豉中的蛋白酶、纖維素酶等多種酶類的活性密切相關(guān)[19-20]。

2.1.2 細菌數(shù)量的變化

由圖2可知，永川豆豉雖然屬于毛霉型豆豉但在制曲和后發(fā)酵過程中也有細菌的參與。永川豆豉發(fā)酵過程中細菌的菌落總數(shù)在豆豉制曲和后發(fā)酵過程與霉菌的變化規(guī)律大致相同。細菌要早于霉菌在制曲第4天（S5）進入對數(shù)增長期，并在制曲結(jié)束時達到高峰2.44×109CFU/g。同樣，細菌總數(shù)在拌料后開始急速下降，在發(fā)酵后的第45天（S12）達到最低值1.84×106CFU/g。在豆豉發(fā)酵中后期，細菌總數(shù)緩慢上升至1.0×108CFU/g左右后基本保持穩(wěn)定，這是由于一些厭氧耐高滲透壓的細菌適應(yīng)了環(huán)境，開始緩慢增長的原因，這些耐高鹽厭氧菌在后發(fā)酵中也起到了關(guān)鍵作用。這些細菌可產(chǎn)生蛋白酶、纖溶酶、淀粉酶及β-葡萄糖苷酶等與豆豉成熟相關(guān)的酶類[19]。

圖2 豆豉發(fā)酵過程中細菌數(shù)量的變化Fig.2 Growth curve of bacteria in Douchi during different fermentation stages

2.1.3 酵母菌數(shù)量的變化

在制曲及后發(fā)酵過程中，使用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法沒有分離到酵母菌。

2.2 PCR擴增結(jié)果

2.2.1 細菌PCR擴增結(jié)果

2.2.1.1 第一次PCR擴增結(jié)果

圖3 細菌16S rRNA基因第一次PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis of the fi rst PCR amplifi cation products of 16S rRNA gene from bacteria

由圖3可知，對細菌16S rRNA基因進行第一次PCR擴增，各泳道均得到長度約1.5 kb的特異性擴增片段，符合預(yù)期擴增片段長度。

2.2.1.2 巢式PCR擴增結(jié)果

以第一次細菌PCR擴增產(chǎn)物作為模板，用GC338f和518r作為引物，擴增出長度約200 bp的片段，條帶清晰，無雜帶，結(jié)果見圖4。

圖4 細菌16S rRNA基因巢式PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 Agarose gel electrophoresis of the nested-PCR amplifi cation products of 16S rRNA gene from bacteria

2.2.2 真菌PCR擴增結(jié)果

2.2.2.1 真菌基因組第一次PCR擴增結(jié)果

圖5 真菌第一次PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.5 Agarose gel electrophoresis of the fi rst PCR amplifi cation products of 18S rRNA gene from fungi

由圖5可知，對真菌18S rRNA基因進行第一次PCR擴增，各泳道均得到特異性擴增片段，位于2 000 bp片段位置附近，符合預(yù)期擴增片段2 075 bp長度。其中發(fā)酵第一天和拌料、后發(fā)酵18 d、成品的PCR產(chǎn)物濃度偏低，這與樣本微生物總量少有關(guān)。

2.2.2.2 巢式PCR擴增結(jié)果

由圖6可知，以第一次真菌PCR擴增產(chǎn)物作為模板，用FF390（F）及GCFR1（R）+作為引物，擴增出長度約390 bp的片段，條帶清晰，無雜帶。

圖6 真菌巢式PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.6 Agarose gel electrophoresis of the nested-PCR amplifi cation products of 18S rRNA gene from fungi

2.2.3 DGGE分析結(jié)果

2.2.3.1 細菌水平變性梯度凝膠電泳圖譜分析

圖7 不同豆豉樣品中的細菌巢式PCR產(chǎn)物的水平DGE圖譜Fig.7 Time-travel DGGE profi le of bacterial nested-PCR amplifi cation products from different Douchi samples

由圖7可知，豆豉發(fā)酵過程中的細菌巢式PCR擴增產(chǎn)物共出現(xiàn)8 條明顯條帶，分別被編號為1～8。經(jīng)測序比對分析，分屬于不同細菌，見表3。

表3 豆豉發(fā)酵過程中細菌鑒定結(jié)果Table 3 Bacterial strains identifi ed during the fermentation of Douchi by DGGE

由表3可知，在永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中共鑒定得到了8 種細菌，分別是魏斯氏菌（Weissella cibaria）、費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、變異棒桿菌（Corynebacterium variabile）、乳酸桿菌（Lactobacillus lindneri）、根瘤菌屬（Mesorhizobium thiogangeticum）、奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odysseyi）、乳酸桿菌（Lactobacillusoligofermentans）。在永川毛霉型豆豉制曲的前5 d細菌種類較多，鑒定到了魏斯氏菌（Weissella cibaria）、費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）、融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、變異棒桿菌（Corynebacterium variabile）、奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odysseyi）、乳酸桿菌（Lactobacillus oligofermentans）6 種細菌。在制曲后期同時發(fā)現(xiàn)有根瘤菌（Mesorhizobium thiogangeticum）的生長，但在進入后發(fā)酵階段消失了。在后發(fā)酵階段，奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odysseyi）、乳酸桿菌（Lactobacillus oligofermentans）和乳酸桿菌（Lactobacillus lindneri）是優(yōu)勢菌群。

2.2.3.2 真菌水平變性梯度凝膠電泳圖譜分析

圖8 不同豆豉樣品中的真菌巢式PCR產(chǎn)物的水平DGGE圖譜Fig.8 Time-travel DGGE profi le of nested-PCR amplifi cation products from fungi in different Douchi samples

如圖8所示，永川毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中的真菌巢式PCR擴增產(chǎn)物共出現(xiàn)了9 條明顯條帶，分別被編號為1～9。經(jīng)測序比對分析，分屬于不同真菌，見表4。

表4 豆豉在發(fā)酵過程中真菌鑒定結(jié)果Table 4 Fungal strains identifi ed during the fermentation of Douchi by DGGE

由表4可知，永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中，可發(fā)現(xiàn)9條明顯條帶，鑒定出匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、有性根霉（Rhizopus sexualis）、總狀毛霉（Mucor racemosus）、大孢聯(lián)軛霉（Syzygites megalocarpus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces sp.）。在制曲階段，其霉菌構(gòu)成沒有發(fā)生顯著變化?？偁蠲故莾?yōu)勢真菌，但伴有多種黑根霉，因此在制曲結(jié)束階段會發(fā)現(xiàn)黑色孢子沉積在大豆上。米根霉的生長是豆豉在制曲后期糖化酶活性到達最大值的重要原因。雖然采用傳統(tǒng)方法沒有分離到酵母菌，但在后發(fā)酵階段，DGGE技術(shù)檢測到結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces sp.）的存在。

2.2.4 微生物區(qū)系聚類分析結(jié)果

根據(jù)發(fā)酵階段樣本，按DGGE條帶有無進行聚類分析。

2.2.4.1 細菌聚類分析結(jié)果

圖9 細菌微生物區(qū)系聚類分析結(jié)果Fig.9 Clustering analysis of bacterial DGGE profi le

由圖9可知，根據(jù)不同發(fā)酵階段豆豉細菌引物擴增DGGE譜帶將其歸為三大類，制曲前5 d歸為一類，制曲6～10 d與拌料、后發(fā)酵18 d歸為一類，成品豆豉單獨聚為一類。說明豆豉制曲過程中細菌區(qū)系前后變化較大，成品豆豉與制曲細菌區(qū)系更是有較大差異。

2.2.4.2 真菌聚類分析結(jié)果

圖10 真菌微生物區(qū)系聚類分析結(jié)果Fig.10 Clustering analysis of fungal DGGE profi le

由圖10可知，永川豆豉制曲過程中真菌微生物區(qū)系變化不明顯，前發(fā)酵過程可以歸為兩類。制曲1～7 d可以聚為一類，制曲8～10 d以及拌料、后發(fā)酵第18天可以聚為一類。成品中真菌微生物區(qū)系與制曲階段有較大差異。

3 討 論

永川毛霉型豆豉在制曲過程中，有細菌的參與。由于是開放制曲，細菌在第4天（S5）進入對數(shù)增長期，細菌總數(shù)在制曲結(jié)束時達到最高峰2.44×109CFU/g。這與汪孟娟等[21]在曲霉型豆豉中的研究結(jié)果相近。在永川毛霉豆豉拌入食鹽、白酒、醪糟后，由于水分活度降低，微生物生長受到抑制，數(shù)量迅速降低。通過PCR-DGGE技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物區(qū)系的變化，共鑒定到了8 種細菌。在制曲階段細菌的菌群區(qū)系變化較大。在制曲初期，蒸煮后的大豆水分活度高，營養(yǎng)豐富，更易于各種微生物的生長。在制曲的第1～5天，魏斯氏菌（Weissella cibaria）是優(yōu)勢菌群，在第6天時消失。融合魏斯氏菌（Weissella confuse）和Weissella cibaria變化規(guī)律一致。在第2～5天可以檢測到費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）的存在，其在第2天含量最高。在第3～5天可以檢測到變異棒桿菌（Corynebacterium variabile），其在第3天含量最高。同時奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odysseyi）和乳酸桿菌（Lactobacillus lindneri）一直存在于發(fā)酵過程中。魏斯氏菌是乳酸菌的分支，可產(chǎn)乳酸，其蛋白酶為酸性蛋白酶。由于魏斯氏菌在制曲前期的快速增長，永川毛霉型豆豉總酸含量和酸性蛋白酶活性也隨之增長，總酸含量的提高對大腸桿菌和變形桿菌有一定的抑制作用。隨著魏斯氏菌的消失，總酸的含量和酸性蛋白酶的活性逐漸降低。由于在制曲第6天毛霉進入對數(shù)增長期，其大量增殖抑制了魏斯氏菌的增長，同時也抑制了費格森埃希菌和變異桿菌這些具有潛在危害的細菌增長。在制曲第6天以后，檢測不到魏斯氏菌和費格森埃希菌以及變異桿菌。這與Chen Tingtao等[22]研究曲霉型豆豉結(jié)果類似。在制曲后期同時發(fā)現(xiàn)有根瘤菌（Mesorhizobium thiogangeticum）的生長，但在進入后發(fā)酵階段消失了。在后發(fā)酵階段，奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odysseyi）、乳酸桿菌（Lactobacillus oligofermentans）和乳酸桿菌（Lactobacillus lindneri）是優(yōu)勢菌群。芽孢桿菌和乳酸菌可以適應(yīng)永川毛霉型豆豉后發(fā)酵過程的高鹽缺氧環(huán)境，可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多種酶，在后發(fā)酵過程中對豆豉品質(zhì)形成發(fā)揮了重要作用。在細菌型豆豉和韓國大醬的品質(zhì)形成中，這兩種菌種也發(fā)揮了重要作用[4,23]。

永川毛霉型豆豉中，細菌主要是在后發(fā)酵階段發(fā)揮作用，對其品質(zhì)形成主要有以下幾方面貢獻：第一，在后發(fā)酵階段乳酸菌產(chǎn)酸，提高了永川豆豉的總酸含量，抑制了其他微生物的增長，并使永川毛霉型豆豉具備了微酸的滋味特征；第二，乳酸菌和芽孢桿菌在后發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多種酶與制曲階段毛霉產(chǎn)生的相關(guān)酶類一起作用于永川毛霉型豆豉。雖然后發(fā)酵階段酶活性低，但作用時間長。在這個過程中豆豉中蛋白、淀粉、脂肪等成分長鏈斷裂水解，形成了其入口化渣的質(zhì)構(gòu)特點，同時氨基酸與還原糖發(fā)生的美拉德反應(yīng)生成的類黑精決定了永川毛霉型豆豉的黝黑色澤，蛋白質(zhì)和脂肪的代謝產(chǎn)物生成的風味物質(zhì)決定了其風味品質(zhì)。

在制曲階段，真菌是主要發(fā)酵菌種。永川毛霉型豆豉真菌菌落總數(shù)在第6天快速增長，并在制曲結(jié)束到達最大值1.760×109CFU/g。真菌菌落總數(shù)在拌料后由于高鹽厭氧環(huán)境以及酒精的作用下迅速降低。真菌菌落總數(shù)在后發(fā)酵過程第75天出現(xiàn)一個生長高峰，不過隨著大量次生代謝產(chǎn)物的增加和酸度的提高而逐漸下降。在制曲階段，永川毛霉型豆豉真菌區(qū)系構(gòu)成沒有發(fā)生顯著變化?？偁蠲梗∕ucor racemosus）是優(yōu)勢真菌。永川毛霉型豆豉中性蛋白酶和堿性蛋白酶活力變化與真菌菌落總數(shù)變化一致?？偁蠲沟臄?shù)量與中性蛋白酶、堿性蛋白酶和纖維素酶的活力密切相關(guān)，關(guān)系到制曲是否成功。同時在制曲階段也發(fā)現(xiàn)了另外4 株真菌：匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、有性根霉（Rhizopus sexualis）、大孢聯(lián)軛霉（Syzygites megalocarpus）以及米根霉（Rhizopus oryzae）。匍枝根霉、有性根霉和米根霉具有分泌糖化酶的能力，對于豆豉中多糖的糖化發(fā)揮了重要的作用，生成的還原糖有利于微生物利用以及美拉德反應(yīng)的進行。同時根霉具有分泌β-葡萄糖苷酶的活性[24]，對于大豆異黃酮由糖苷型向苷元型的轉(zhuǎn)化具有重要意義。在對大豆異黃酮構(gòu)成的分析中也證實異黃酮的轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在制曲階段。但如果匍枝根霉過多會引起制曲中豆豉變黑，影響制曲效果。在后發(fā)酵階段發(fā)現(xiàn)了結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces sp.），結(jié)合酵母在納豆、味增和曲霉型豆豉的后發(fā)酵中都有發(fā)現(xiàn)，它可以分泌多種酶類，有利于蛋白質(zhì)、脂肪等降解，為大豆發(fā)酵食品的風味形成有重要貢獻[23]。

毛霉等霉菌在制曲期間所產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶等酶不但在制曲期間發(fā)揮作用，而且在后發(fā)酵期間也發(fā)揮作用[25-26]，如果制曲期間真菌生長不夠旺盛，會影響后發(fā)酵時間和產(chǎn)品質(zhì)量。真菌在永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中有以下幾方面作用：第一，毛霉是制曲過程中的主要微生物，是蛋白酶和纖維素酶等酶的主要來源。第二，根霉分泌的淀粉酶、糖化酶對于大豆中淀粉轉(zhuǎn)化成還原糖具有重要意義，還原糖的產(chǎn)生有利于微生物發(fā)酵，同時對豆豉的色澤和回甘滋味特征形成具有重要意義。第三，根霉具有分泌β-葡萄糖苷酶的能力，使大豆中不具備生物活性的糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化成為具備生物活性的苷元型異黃酮，使永川毛霉型豆豉具備更高的保健功能。

永川毛霉型豆豉在制曲過程中的真菌主要以總狀毛霉為主，輔以米根霉、大孢聯(lián)軛霉、有性根霉、匍枝根霉，這些霉菌在生長過程中分泌了高活力的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、糖化酶等，為后發(fā)酵儲備了多種酶系。在后發(fā)酵階段，發(fā)揮作用的微生物主要有耐鹽厭氧的芽孢桿菌、乳酸菌、結(jié)合酵母。在這些微生物生成多種酶系的作用下蛋白、脂肪、淀粉等發(fā)生降解，形成了永川毛霉型豆豉的品質(zhì)特征。

4 結(jié) 論

永川毛霉型豆豉在制曲過程中霉菌和細菌增長規(guī)律一致，制曲前期增長緩慢，后期呈對數(shù)增長，并在制曲結(jié)束時菌落總數(shù)最高。拌料進入后發(fā)酵階段，菌落總數(shù)快速下降，并保持較低水平。在制曲前期有多種乳酸菌生長，后期乳酸菌受到霉菌增長的抑制，種類減少。在后發(fā)酵階段，奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odysseyi）、乳酸桿菌（Lactobacillus oligofermentans）和乳酸桿菌（Lactobacillus lindneri）是優(yōu)勢菌群。同時在制曲初期也發(fā)現(xiàn)了費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）等雜菌生長。永川毛霉型豆豉制曲階段優(yōu)勢霉菌是總狀毛霉（Mucor racemosus），同時伴有有性根霉（Rhizopus sexualis）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、大孢聯(lián)軛霉（Syzygites megalocarpus）、米根霉（Rhizopus oryzae）的生長，后發(fā)酵階段有結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces sp.）的參與。

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Changes in Microbial Load and Flora during Fermentation Yongchuan Mucor-Type Douchi

SUO Huayi1,2, ZHAO Xin3, QIAN Yu3, CHEN Juan4, LI Jian4, ZHANG Yu1,2, KAN Jianquan1,2,*
(1. College of Food S cience, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing 400715, China; 3. School of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 4. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

The traditional Yongchuan Douchi has a unique flavor and is always greatly loved by consumers. Its unique flavor is produced by interaction of the complex microbial flora. Nested polymerase chain reaction (Nested-PCR) and denaturing gel gradient electrophoresis (DGGE) were adopted to analyze the microfl ora ecological evolution of Yongchuan Douchi during fermentation and it was found that in the koji-making process, the amounts of molds and bacteria exhibited a logarithmic growth trend and the total number of colonies rapidly declined during the late stage of fermentation and then remained stable at a lower level. A variety of lactic acid bacteria increased during the early stage of koji-making and the number of species of lactic acid bacteria decreased during the late stage due to the growth inhibition by molds. At the late stage of fermentation, Bacillus odysseyi, Lactobacillus oligofermentans and Lactobacillus lindneri were the dominant bacteria. Besides, it was also found that infectious microbes such as Escherichia fergusonii grew at the beginning of kojimaking. The dominant mould of Yongchuan Douchi during the entire koji-making period was always Mucor racemosus, which was accompanied by the growth of Rhizopus sexualis, Rhizopus stolonifer, Syzygites megalocarpus, and Rhizopus oryzae as well as Zygosaccharomyces sp. during the late phase of fermentation.

Yongchuan Douchi; microflora; nested-polymerase chain reaction (PCR); denaturing gel gradient electrophoresis (DGGE)

TS214.2

A

1002-6630（2015）19-0124-08

10.7506/spkx1002-6630-201519022

2014-12-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31201411）

索化夷（1978-），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵微生物。E-mail：birget@swu.edu.cn

*通信作者：闞健全（1965-），男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：ganjq1965@163.com