王祖鵬，許 偉，邵 榮，韋 萍

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051）

基于定點(diǎn)突變改善中性植酸酶催化特性及結(jié)構(gòu)-效應(yīng)分析

王祖鵬1,2，許 偉2，邵 榮2，韋 萍1,*

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051）

對前期設(shè)計(jì)的來源于淀粉液化芽孢桿菌DSM 1061的3 種中性植酸酶突變體（D148E/H149R、Q67E/N68R、D191E）的穩(wěn)定性及催化效率等進(jìn)行研究，并對影響其性質(zhì)的結(jié)構(gòu)因素進(jìn)行分析。結(jié)果表明：與野生酶相比，在85 ℃條件下，突變體D191E半衰期延長了4.3 min，但催化效率下降為野生酶的48.9%；突變體D1 48E/H149R催化效率為野生酶的229%，半衰期與野生酶基本一致；突變體Q67E/N68R催化效率為野生酶的93%，半衰期延長了0.7 min。圓二色光譜分析結(jié)果顯示，D148E/H149R催化效率提高最為顯著，α-螺旋含量由野生酶中11.79%降至2.90%，無規(guī)卷曲含量增加；Q67E/N68R性質(zhì)與野生酶接近，其二級結(jié)構(gòu)變化最小；D191E催化效率降低，α-螺旋含量增加至24.59%。對野生酶和突變酶的同源模型分析發(fā)現(xiàn)，殘基D191具有較大的B因子值，不利于酶的熱穩(wěn)定性，各突變殘基周圍的氫鍵有所變化。同源模型的分析也將為植酸酶的進(jìn)一步改良提供理論依據(jù)。

中性植酸酶；定點(diǎn)突變；催化效率；圓二色光譜

植酸酶是一類能催化植酸鹽降解成肌醇和無機(jī)磷的酶的總稱[1]。植酸酶作為飼料添加劑，能夠提高植物性飼料中磷的利用率和單胃動(dòng)物對礦質(zhì)元素的吸收率，并能減少磷對環(huán)境的污染[2]。植酸酶來源廣泛，普遍存在于細(xì)菌[3-4]、真菌[5]以及動(dòng)植物組織[6]中。目前商品化的植酸酶幾乎都是酸性植酸酶，然而酸性植酸酶僅適合胃中pH值呈酸性的單胃動(dòng)物以及少數(shù)魚類如虹鱒等，不適用于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖量最大的消化道為中性的鯉科魚類[7]。來源于芽孢桿菌的中性植酸酶屬于3-植酸酶（EC 3.1.3.8）和β-螺旋槳植酸酶[8- 9]，其具有最適pH值接近中性、酶活性高、熱穩(wěn)定性好[10]等特性，可廣泛應(yīng)用于魚類飼料。

近年來，中性植酸酶基因工程菌的構(gòu)建及其活性的提高成為廣大科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)。有學(xué)者成功將芽孢桿菌植酸酶基因在大腸桿菌中表達(dá)，但存在重組酶活性偏低等問題[11-12]。利用生物信息學(xué)對現(xiàn)有的大量酶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合定點(diǎn)突變等分子生物學(xué)技術(shù)，對現(xiàn)有的酶進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，可以使其具有預(yù)期的優(yōu)良性質(zhì)[13-14]。不少學(xué)者利用這些手段對植酸酶的構(gòu)象和催化機(jī)理進(jìn)行研究，Osman等[15]利用同源建模結(jié)合定點(diǎn)突變的方法證實(shí)了Y78位于芽孢桿菌（Bacillus sp.）植酸酶的催化活性中心。Zeng Yifang等[16]利用晶體模型闡述了Bacillus植酸酶與二價(jià)金屬離子復(fù)合并與底物結(jié)合催化的機(jī)理。酶的熱穩(wěn)定性是酶的重要性質(zhì)之一，熱穩(wěn)定性的增加能拓寬酶的應(yīng)用范圍[17]，將這些手段相結(jié)合能較快獲得兼具高活力和熱穩(wěn)定性的中性植酸酶。在中性植酸酶的分子改造方面，Oh等[18]對淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）DS11植酸酶進(jìn)行了一系列的單點(diǎn)突變研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變酶D314A、E211A、E260A和Y159F喪失活性，其余幾種突變酶催化效率kcat/Km顯著下降，最高僅為野生酶的48.81%。Shim等[19]對來源于B. amyloliquefaciens DS11的植酸酶進(jìn)行突變，但得到D56A、D56E、D308A、D308E等突變體的催化效率kcat/Km與野生酶相比均有所降低。

本實(shí)驗(yàn)室前期已獲得來源于B. amyloliquefaciens DSM 1061的新型中性植酸酶基因[8]，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進(jìn)行了高效表達(dá)[20]及定點(diǎn)突變研究，獲得3 種中性植酸酶突變體（D148E/H149R、Q67E/N68R和D191E）[21]。本研究對中性植酸酶3 種突變體的催化效率和熱穩(wěn)定性進(jìn)一步研究，通過圓二色光譜分析突變酶的結(jié)構(gòu)變化，利用同源建模的方法探討可能影響酶熱穩(wěn)定性的因素，對突變部位的氫鍵及突變殘基的B因子進(jìn)行分析，為后期酶學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

重組E. coli BL21（DE3）/pET22b（+）-phyc菌株為鹽城工學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 試劑

植酸鈉、蛋白Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母膏、蛋白胨 英國Oxoid公司；考馬斯亮藍(lán)G250、考馬斯亮藍(lán)R250、咪唑、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；蛋白純化試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV752N紫外-可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；DYY-8C垂直電泳儀 北京六一儀器廠；J-810型圓二色光譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 中性植酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將保存于－80 ℃的3 種含中性植酸酶突變基因的菌株及原始菌株在含氨芐（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB平板劃線，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。挑取原始菌株及突變菌分別轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下，180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600 nm≈0.6～0.8），分別加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（終濃度1.0 mmol/L），置于20 ℃條件下，180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h。取適量誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液，8 000 r/min離心15 min收集菌體，用無菌水洗滌2 次后，菌體重懸于0.5 mL（pH 7.0，50 mmol/L）Tris-HCl緩沖液中，超聲波破碎菌體細(xì)胞。破胞條件為：超聲功率400 W，工作時(shí)間3 s，間歇3 s，在冰浴環(huán)境中循環(huán)200 次。將超聲破碎后的樣品在12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清即為粗酶液。

1.3.2 突變酶的純化

蛋白質(zhì)純化采用Ni-Agarose 6×His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒在4 ℃條件下進(jìn)行純化。純化步驟如下：用10 倍體積平衡液（20 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl）平衡層析柱，平衡結(jié)束后將粗酶液上樣，進(jìn)樣速率為0.25 mL/min。上樣結(jié)束后，用平衡液洗去雜蛋白，再用洗脫液（500 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl）洗下目的蛋白，純化效果利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測。將含目的蛋白的洗脫液置透析袋（截留分子質(zhì)量8～14 kD）中透析除鹽。

1.3.3 中性植酸酶酶學(xué)性質(zhì)測定

中性植酸酶的酶活力測定方法參考GB/T 18634-2009《飼用植酸酶活性的測定 分光光度法》，并稍作修改。植酸鈉終濃度為5.0 mmol/L，反應(yīng)體系CaCl2的終濃度為2 mmol/L，緩沖體系為Tris-HCl緩沖液（0.25 mol/L，pH 7.0）。取0.2 mL酶液與上述底物混合，反應(yīng)總體積6 mL。將上述混合物置于37 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入4 mL顯色及終止液終止反應(yīng)，于415 nm波長處測定無機(jī)磷的含量。

酶活力單位（U）定義：在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol無機(jī)磷所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.3.3.1 中性植酸酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定

反應(yīng)體系中采用不同的底物濃度，使其終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L。置于酶的最適溫度和pH值條件下水浴反應(yīng)30 min，加入4 mL顯色及終止液終止反應(yīng)，測定酶活力，以雙倒數(shù)作圖法確定Km和vmax，并根據(jù)酶濃度計(jì)算催化常數(shù)kcat，進(jìn)一步求得催化效率kcat/Km[21]。

1.3.3.2 中性植酸酶半衰期測定

半衰期是指特定溫度下酶活力喪失一半的時(shí)間，是表征酶熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要參數(shù)。將野生酶和突變酶在85 ℃條件下分別保溫0、2、4、6、8、10 min后37 ℃條件下測定酶活力，得出酶活力下降至50%時(shí)所對應(yīng)的保溫時(shí)間。

1.3.4 中性植酸酶的圓二色光譜掃描

將野生酶與突變酶的濃度調(diào)成一致，酶溶液中含有終濃度為2 mmol/L的Ca2+。利用圓二色光譜儀在200～240 nm范圍內(nèi)掃描，測定幾種中性植酸酶突變體的圓二色性。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性植酸酶的SDS-PAGE分析

圖1 植酸酶的SDS-PAGGEE圖Fig.1 SDS-PAGE of mutant phytases

對大腸桿菌中表達(dá)的中性植酸酶突變酶蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE檢測，如圖1所示，結(jié)果表明經(jīng)過鎳柱純化后獲得單一條帶，即為均一的植酸酶蛋白，已達(dá)到電泳純。突變酶分子質(zhì)量與野生酶一致[20]，約為42 kD。

2.2 中性植酸酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

運(yùn)用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，繪制野生酶及突變酶的動(dòng)力學(xué)曲線，通過方程求得植酸酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。再根據(jù)vmax=kcat[E]計(jì)算催化常數(shù)kcat，進(jìn)一步計(jì)算催化效率kcat/Km。表1列出了野生酶和突變酶的米氏常數(shù)、最大反應(yīng)速率等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與野生酶相比，D148E/H149R的最大反應(yīng)速率vmax提高了62%，其催化效率提高最為顯著，為野生酶的229%。D148E/H149R的米氏常數(shù)Km變化不明顯，只降低了5%，但其催化效率有大幅提高，推測這與最大反應(yīng)速率的提高有關(guān)。Q67E/N68R的最大反應(yīng)速率比野生酶下降了11.8%，催化效率為野生酶的93.0%。D191E的最大反應(yīng)速率下降為野生酶的51.3%，催化效率降低明顯，僅為野生酶的48.9%。Oh等[18]對來源于B. amyloliquefaciens DS11的植酸酶進(jìn)行研究，獲得的突變體R122E催化效率僅為野生酶的48.81%。Shim等[19]得到的突變體催化效率也普遍降低，突變體D308E催化效率最高，也僅為野生酶的94.04%。與之相比，本課題組獲得的突變體D148E/H149R催化效率提高幅度更為顯著。Tran等[22]對來源于Bacillus sp. MD2的堿性植酸酶突變，獲得的突變體E229V的最高活力達(dá)到37.8 U/mg，與本研究所得到的突變體D148E/H149最高反應(yīng)速率32.19 U/mg接近。

表1 植酸酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of mutant phytases

2.3 中性植酸酶半衰期

在特定的條件下，酶的半衰期越長，說明酶的穩(wěn)定性越好。在含有2 mmol/L Ca2+的環(huán)境中，85 ℃條件下保溫不同時(shí)間，酶活力殘留曲線如圖2所示，突變體D148E/H149R、Q67E/N68R 與野生酶變化趨勢接近，而D191E酶活力下降緩慢。野生酶的半衰期為3.5 min，D148E/H149R的半衰期與野生酶接近，為3.6 min，Q67E/N68R的半衰期為4.2 min；D191E的半衰期最長，為7.8 min。與野生酶相比，D191E的半衰期延長了4.3 min，熱穩(wěn)定性顯著提高。Yao Mingze等[23]得到的來源于大腸桿菌的植酸酶，在85 ℃條件下處理，酶的剩余活力下降顯著，最終穩(wěn)定在20%左右，本課題組獲得的突變體D148E/H149R、Q67E/N68R以及野生酶的變化與之相似，而D191E顯示出較好的熱穩(wěn)定性。

圖2 植酸酶的熱穩(wěn)定曲線Fig.2 Thermal inactivation curves of mutant phytases

2.4 中性植酸酶的圓二色光譜

圓二色光譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單、較準(zhǔn)確的方法，已受到研究者的廣泛關(guān)注[24]。如張耀華等[25]利用圓二色光譜研究了pH值對植酸酶穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液pH值由5變?yōu)?時(shí)，植酸酶二級結(jié)構(gòu)變化較大，α-螺旋含量由84.27%變?yōu)?9%。利用圓二色光譜分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)突變酶和野生酶蛋白結(jié)構(gòu)間的差異。野生酶及突變酶的圓二色光譜如圖3所示，D191E、D148E/H149R的圓二色光譜與野生酶相差較大，Q67E/N68R則與野生酶最為相近。利用CDPro軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算出野生酶及突變酶的各個(gè)二級結(jié)構(gòu)的含量，如表2所示。野生酶α-螺旋的含量為11.79%，β-折疊含量為41.26%。圓二色光譜顯示酶的空間結(jié)構(gòu)與酶的活力密切相關(guān)，D148E/H149R酶催化效率提高，α-螺旋含量降低至2.90%，無規(guī)卷曲含量增加；D191E催化效率降低，α-螺旋含量提高至24.59%；Q67E/N68R性質(zhì)與野生酶接近，二級結(jié)構(gòu)變化最小。Correia等[26]利用圓二色光譜分析溫度和溶劑對植酸酶穩(wěn)定性的影響，當(dāng)熱處理溫度由25 ℃升高至60 ℃，3-植酸酶α-螺旋含量由61.3%降至23.9%，6-植酸酶的α-螺旋含量由49.0%下降到15.9%，無規(guī)卷曲含量均增加。本研究中，突變酶二級結(jié)構(gòu)的改變可能是由于突變后的氨基酸改變影響了原有酶蛋白α-螺旋等結(jié)構(gòu)的形成，其中D148E/H149R中α-螺旋的含量減少，無規(guī)卷曲的含量增加，使得酶分子柔性增加，利于酶與底物的結(jié)合，獲得更高的催化效率；而D191E則相反，α-螺旋含量的增加可能提高了酶的剛性，使得酶熱穩(wěn)定性提高，與文獻(xiàn)[26]報(bào)道相吻合。

圖3 植酸酶的圓二色光譜Fig.3 Circular dichroism of mutant phytases

表2 植酸酶的二級結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure contents of phytases determined by CD spectroscopy%

2.5 突變殘基部位氫鍵的變化

穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力主要是一些非共價(jià)鍵或次級鍵包括氫鍵、范德華力、疏水作用、鹽鍵等。其中氫鍵是使酶蛋白高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要作用力[27]。利用SWISS-MODEL服務(wù)器，對刪除信號肽的野生酶和突變酶進(jìn)行同源建模，利用軟件Swiss-PdbViewer 4.10對突變酶的同源模型進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)氨基酸殘基5 ?半徑內(nèi)突變前后氫鍵的變化。如表3和圖4所示，突變后氨基酸殘基周圍的氫鍵數(shù)目及位置有所變化。通過同源模型觀察到突變后E191殘基的OE2能與N193殘基的ND2間形成氫鍵，研究也證實(shí)，將D191殘基突變成谷氨酸之后，酶的熱穩(wěn)定性顯著增加，推斷這樣形成的氫鍵能有效地增加酶分子表面的剛性，從而增加酶的穩(wěn)定性[27]。與野生酶相比，突變體Q67E/N68R的氫鍵數(shù)目有所增加，發(fā)現(xiàn)將N68殘基突變?yōu)榫彼岷?，其能與D62形成2個(gè)氫鍵。結(jié)果表明，Q67E/N68R穩(wěn)定性略有提高，推測這與氫鍵數(shù)目的增加有關(guān)。突變體D148E/H149R與野生酶相比，5?的半徑內(nèi)氫鍵增加了2個(gè)，將H149殘基突變成R149之后能夠與D191殘基間形成氫鍵，氫鍵數(shù)目也有所增加，但熱穩(wěn)定性的提高并不明顯。

表3 突變殘基的氫鍵變化統(tǒng)計(jì)Table 3 Hydrogen bond number around mutation residues of phytases

圖4 突變前后殘基氫鍵的變化Fig.4 Changes of hydrogen bonds before and after the mutation of phytases

2.6 突變殘基的B因子值分析

B因子值體現(xiàn)了晶體中原子電子密度的“模糊度”，即蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象狀態(tài)。B因子值越高，“模糊度”越大，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定[28]，對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響越大。可以根據(jù)B因子值來分析穩(wěn)定性。Reetz等[29]根據(jù)測定各個(gè)氨基酸殘基的B因子值選擇不利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定的氨基酸殘基進(jìn)行突變來提高酶的熱穩(wěn)定性。利用網(wǎng)站服務(wù)器（http://spinportal.magnet.fsu. edu/bfactors/）對中性植酸酶各個(gè)氨基酸的B因子值進(jìn)行預(yù)測。所選突變氨基酸的B因子值如表4所示。D191殘基的B因子值最高，說明D191殘基所處部位最不穩(wěn)定，理論上對植酸酶的熱穩(wěn)定性影響最大。結(jié)果也證實(shí)，在這些突變殘基中，D191殘基對植酸酶的熱穩(wěn)定性影響最大，將D191這一氨基酸殘基突變后得到的D191E熱穩(wěn)定性大幅提高。而H149、N68等氨基酸殘基的B因子值相對較小，說明其構(gòu)象穩(wěn)定，對酶的熱穩(wěn)定性影響不大，D148E/H149R、Q67E/N68R這兩個(gè)突變體熱穩(wěn)定性改善不是很明顯。

表4 植酸酶殘基的B因子值Table 4 B-factor values of amino acid residues in phytases

2.7 突變體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系分析

突變體D148E/H149R、Q67E/N68R、D191E位于酶分子的表面，未對植酸酶的保守序列進(jìn)行改變，避免了對活性中心改變而造成的酶催化活力的喪失。酶活力和穩(wěn)定性通常存在著一種平衡[30]，突變后酶活力的提高往往造成穩(wěn)定性的下降，與之類似，本研究中突變體D148E/H149R催化效率是野生酶的2.29 倍，但半衰期與野生酶相近；與野生酶相比，突變體D191E穩(wěn)定性大幅度提高，但催化效率卻顯著下降。從其結(jié)構(gòu)模型可以看出，D191殘基位于蛋白質(zhì)的Loop環(huán)上，谷氨酸代替天冬氨酸之后擁有更大的側(cè)鏈，同時(shí)能和N193殘基的ND2形成氫鍵，推測這增加了酶蛋白表面的剛性。研究顯示β-螺旋植酸酶分子酶的活性中心比較狹窄[31]，D191殘基這一改變可能影響到了酶活力中心與底物的結(jié)合，從而使得其催化效率降低明顯。通常情況下氫鍵的數(shù)目增加后，酶的穩(wěn)定性會(huì)提高，但氫鍵只是影響酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素之一，如D191殘基突變后，在氫鍵數(shù)目未增加的情況下，穩(wěn)定性卻大幅提高，說明還存在其他諸多因素影響著蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，在今后的研究中，將進(jìn)一步探索使得突變體穩(wěn)定性大幅提升的原因。另外D191殘基的B因子值比較大，說明了D191構(gòu)象的不穩(wěn)定，突變后其熱穩(wěn)定性得到大幅度提高。圓二色光譜顯示D191E的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量明顯增加，這使得酶表面的剛性增加，也與熱穩(wěn)定性的提高有關(guān)。D148、H149是位于酶表面的非保守氨基酸，圓二色光譜顯示D148E/H149R的α-螺旋含量降低最顯著，無規(guī)卷曲含量明顯增加，可能使得酶柔性增加，能更好地與底物結(jié)合，從而提高催化效率。Q67、N68同樣是位于酶表面的非保守氨基酸，突變體Q67E/N68R的二級結(jié)構(gòu)與野生酶相似，α-螺旋等結(jié)構(gòu)含量未發(fā)生明顯改變。

3 結(jié) 論

獲得的突變體D148E/H149R的最大反應(yīng)速率vmax提高了62%，催化效率為野生酶的229%，提高了植酸酶的利用率。Q67E/N68R催化效率是野生酶的93.0%，半衰期延長了0.7 min，性質(zhì)改變不明顯。85 ℃條件下D191E的半衰期比野生酶延長了4.3 min，能更好地避免因高溫而造成的酶活力損失。圓二色光譜顯示突變酶之間結(jié)構(gòu)存在差異，與野生酶相比，D148E/H149R的α-螺旋含量降低，無規(guī)卷曲含量增加。同源模型結(jié)構(gòu)顯示，突變殘基周圍氫鍵數(shù)目和位置均有所改變，對突變殘基的B因子值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)D191的B因子值較高，D191E熱穩(wěn)定性的提高與不穩(wěn)定殘基D191的突變有關(guān)。研究中所獲得的突變體多數(shù)是在單一方面性能的大幅改善，要獲得高催化效率及熱穩(wěn)定性優(yōu)良的植酸酶需要經(jīng)過多次突變和反復(fù)地篩選，酶分子同源模型的構(gòu)建也為后期對酶學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步改良提供依據(jù)。

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Improvement of Catalytic Properties and Structure-Activity Relationship of Neutral Phytase Based on Site-Directed Mutagenesis

WANG Zupeng1,2, XU Wei2, SHAO Rong2, WEI Ping1,*
(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China; 2. School of Marine and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China)

Three mu tations (D148E/H149R, Q67E/N68R and D191E) of neutral phytase from Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 have designed in our previous study. Enzymatic properties such as thermostability and catalytic effi ciency were studied in this paper. The structural changes were analyzed to explore the relationship with properties of mutant phytases. The results showed that the half-life of D191E was 4.3 min longer than that of wild-type phytase at 85 ℃, but its catalytic effi ciency reduced to 48.9% of wild-type phytase. The catalytic effi ciency of mutant D148E/H149R was increased to 229% of wild-type phytase although the half-life was similar. The catalytic efficiency of Q67E/N68R was 93% of wild-type phytase and the half-life was extended by 0.7 min. Circular dichroism showed that the catalytic effi ciency of D148E/H149R was improved most obviously while the content of α-helix decreased from 11.79% to 2.90%, and the content of random coil was increased. The structure of Q67E/N68R changed little and its properties were closed to those of wild-type phytase. The α-helical content of D191E increased to 24.59% while the catalytic effi ciency decreased a lot. Using homologous models to analyze the factors which may affect the thermal stability of phytases, we found that the B-factor value of D191 was high so that it was unfavorable to the stability of phytase. The hydrogen bonds around mutation residues also changed. Homologous model analysis will provide the theoretical basis for further study of phytase.

neutral phytase; site-directed mutagenesis; catalytic effi ciency; circular dichroism

Q55

A

1002-6630（2015）19-0118-06

10.7506/spkx1002-6630-201519021

2014-12-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101912）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2011420）；江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目

王祖鵬（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊腹こ獭-mail：wzp9012@163.com

*通信作者：韋萍（1961-），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯こ?。E-mail：weiping@njtech.edu.cn