李　恒，李莉梅，何春梅，朱　苗，周鮮嬌，曾富華，*

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江524048；2.廣東高校邊緣熱帶特色植物工程技術開發(fā)中心，廣東湛江524048）

野生仙人掌多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

李恒1，李莉梅2，何春梅1，朱苗1，周鮮嬌1，曾富華1，*

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江524048；2.廣東高校邊緣熱帶特色植物工程技術開發(fā)中心，廣東湛江524048）

優(yōu)化熱水浸提法提取野生仙人掌多糖（Opuntia dillenii Haw.polysaccharides，ODPs）的工藝。在單因素實驗的基礎上，利用Box-Behnken實驗和響應面分析法，研究提取溫度、提取時間以及液料比對ODPs提取結果的影響；通過回歸分析模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型；最后測定不同提取溫度下ODPs蛋白質含量及DPPH自由基清除率。結果顯示，最佳提取工藝為提取溫度93℃，液料比62∶1，提取時間3.5h，由模型預測得率達到25.14%，驗證實驗結果為25.05%，與預測值較接近，表明模型具有較好預測性。提取溫度、液料比、提取時間對野生仙人掌多糖得率的影響具有統(tǒng)計學意義（p＜0.001）。提取溫度為95℃時，多糖含量、DPPH自由基清除率都最高，但多糖中蛋白質含量也最高。說明響應面優(yōu)化得到的提取工藝有利于提高ODPs得率，95℃的提取溫度有利于增加多糖的抗氧化活性。

野生仙人掌，多糖，提取，響應面，抗氧化

野生仙人掌是仙人掌科、仙人掌屬的一種植物，主要分布在熱帶亞熱帶地區(qū)，在我國南方的分布也很廣。它與墨西哥仙人掌一樣，具有較高的營養(yǎng)價值[1-2]，并且具有降膽固醇、降血糖、調節(jié)免疫功能等作用[3-7]。但是，目前它的利用率卻遠比墨西哥仙人掌低，資源浪費嚴重。從野生仙人掌中分離所得的野生仙人掌多糖（Opuntia dillenii Haw.polysaccharides，ODPs）是仙人掌重要有效成分之一，本研究小組前期的研究及國外的研究已發(fā)現ODPs具有降血糖[8]、降血脂[9-11]、抗癌、調節(jié)免疫[12]、抗氧化[13]、促傷口愈合及護肝等藥理作用[14-16]。因此，本研究從資源開發(fā)以及節(jié)約能源的角度出發(fā)，進一步優(yōu)化ODPs的提取條件，旨在提高得率的同時降低能源的消耗。

響應面優(yōu)化法是一種實驗條件尋優(yōu)的方法，近年來廣泛用于各種活性物質提取條件的優(yōu)化[17-18]，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產品產量的一種有效方法。相對于正交實驗，它可以連續(xù)的對實驗的各個水平進行分析，而正交實驗只能對孤立的實驗點進行分析。因此，本文采用Box-Behnken實驗設計和響應面分析法優(yōu)化ODPs的提取條件，并初步探索提取溫度對ODPs清除DPPH自由基活性的影響，以獲得抗氧化活性及得率均較高的工藝條件，促進野生仙人掌的利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮野生仙人掌采自湛江東海島附近，經本院陳燕副教授鑒定為Opuntia dillenii Haw.；考馬斯亮藍G250、阿拉伯糖FLUKA BioChemika公司；苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇國產分析純。

CR22E高速冷凍離心機日本日立公司；FreeZone 4.5L凍干機美國Labconco公司；TU-1800S型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；LABOROTA 4003-control型旋轉蒸發(fā)儀德國Heidolph公司。

1.2實驗方法

1.2.1野生仙人掌多糖（ODPs）水提工藝新鮮仙人掌除刺，洗凈，切碎至黃豆顆粒大小，用80%食用酒精浸泡至綠色明顯褪去，殘渣烘干，粉碎過60目篩得仙人掌干粉。準確稱取仙人掌干粉，熱水浸提，8000r/min離心15min，合并上清液，減壓濃縮至原體積1/4。用95%乙醇醇沉，8000r/m離心20min，得白色沉淀凍干即得ODPs。

1.2.2標準曲線的制作多糖含量以總糖計，按文獻[19]用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖質量濃度（X）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標，得標準曲線回歸方程為A=0.02X-0.007（R2=0.9999）。

蛋白質含量按參考文獻[20]測定。以蛋白質質量濃度（X）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標，得標準曲線回歸方程為A=0.008x+0.0123（R2=0.9991）

1.2.3指標的計算

式中：A1為熱水浸提所得ODPs的質量（g）；A2為仙人掌干粉的質量（g）。

式中：Y為通過標準曲線計算所得的葡萄糖質量濃度（mg/mL）；V為樣品溶液總體積（mL）；B為樣品總質量（g）；D為樣品稀釋倍數。

式中：E為通過標準曲線計算所得的蛋白質質量濃度（mg/mL）；V為樣品溶液總體積（mL）；M為樣品總質量（g）；R為樣品稀釋倍數。

1.3單因素實驗

設定提取溫度95℃、液料比為60∶1（水與仙人掌干粉質量比），提取時間為3h，固定其中兩個條件，分別考察溫度（60、70、80、90、95、100℃）、液料比（40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1）、提取時間（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h）對ODPs含量的影響。

1.4響應面法優(yōu)化提取工藝

根據單因素實驗的結果以及Box-Behnken中心組合實驗設計原理，進行提取溫度、液料比、提取時間三因素三水平的響應面分析，以ODPs得率為響應面值，采用Design Expert軟件進行多元回歸擬合，實驗因素水平編碼設計見表1。

表1　Box-Behnken設計因素與水平表Table.1　Factors and levels for Box-Behnken experimental design

1.5提取溫度對ODPs清除DPPH自由基活性的影響

設定液料比為60∶1，提取時間為3h，考察溫度（60、70、80、90、95、100℃）對ODPs蛋白質含量以及DPPH清除率的影響。

圖1　提取溫度對ODPs含量的影響Fig.1　Effect of temperature on the polysaccharides content of crude extracts

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.1.1提取溫度對ODPs含量的影響如圖1所示，當提取溫度升高時，多糖含量呈現上升趨勢。尤其是60～70℃和90～95℃，上升的幅度較大。而水平70～90℃，上升幅度較平緩，結果差異不大。當溫度上升至100℃時，多糖含量反而下降。所以，選擇80、90、100℃三個水平進行響應面分析。一般認為，溫度上升更有利于植物細胞的破碎，多糖溶出量增加。但是，實驗過程中發(fā)現，溫度達到100℃時，提取液變得非常粘稠，表明多糖的組成發(fā)生了變化?？赡苓^高的溫度容易導致多糖糖苷鍵斷裂而變性失活。

2.1.2液料比對ODPs含量的影響如圖2所示，液料比為60∶1時，多糖含量最高。在液料比達到60∶1之前，隨著提取溶劑用量的增加，多糖含量增加。但是，當溶劑的量超過物料的60倍時，所得多糖的含量反而下降。提示60倍的溶劑已經可以將ODPs充分溶解，再增加溶劑用量對多糖含量影響不大。因此，選擇液料比為50∶1、60∶1、70∶1三個水平進行響應面分析。

圖2　液料比對ODPs含量的影響Fig.2　Effect of liquid-to-material ratio on the polysaccharides content of crude extracts

2.1.3時間對ODPs含量的影響延長浸提時間有利于多糖的充分溶出。如圖3所示，隨著提取時間的延長，所得多糖含量上升。而且，在1.5～2.0h和3.0～4.0h時，所得多糖含量上升幅度較大；而在2.0～3.0h范圍，則沒有明顯的上升。從節(jié)約成本的角度考慮，選擇2.0、3.0、4.0h三水平進行響應面分析。

圖3　提取時間對ODPs含量的影響Fig.3　Effect of extraction time on the polysaccharides content of crude extracts

2.2響應面結果方差分析

通過Design-Expert v.8.0.6軟件計算獲得提取溫度（A）、提取時間（B）和液料比（C）三種因素與多糖得率的二次多項回歸方程，如下所示，

ODPs得率=23.98+2.57A+2.73B+2.33C+0.81AB-0.56AC-2.45BC-4.64A2-3.02B2-3.45C2

表2　響應面實驗設計及結果Table.2　Box-Behnken experimental design matrix with experimental and predicted values on the yield of ODPs

表3　回歸方程系數顯著性檢驗Table.3　Regression coefficients and their statistical significance

通過該方程可以計算實驗的預測值。可以用決定系數R2來評價回歸方程的優(yōu)劣，R值越接近于1，說明則實驗值與預測值的相關性越好[21]，本研究結果中相關系數模型的決定系數R2為0.9827，表明仙人掌多糖得率的實驗值與預測值之間具有很好的一致性，模型預測性越好。調整后相關系數（Adj R2）為0.9704，則說明該模型能解釋97.04%響應值的變化，有約總變異的2.96%不能由此回歸模型來解釋。模型的信噪比（Adeq precision）達到22.777（＞4），說明方程的擬合度很高，即該模型可用于預測。如方差分析結果所示，模型具有顯著的統(tǒng)計學意義（p＜0.0001），而且，失擬項在α=0.05水平上不顯著（p＞0.05），表明該方程對實驗擬合情況好，實驗誤差小。CV值較低（6.21%），表明實驗精確度較高，重復性好。

表4　二次模型的方差分析統(tǒng)計Table.4　Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

表3顯示，一次項提取溫度（A）、提取時間（B）和液料比（C），交互項提取時間與液料比（BC），三種因素的二次項（A2、B2、C2）對ODPs得率都具有顯著的影響。比較各組F值，各因素對ODPs得率影響的大小順序依次為：液料比＞提取溫度＞提取時間。

圖4　各兩因素交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.4　Response surface pilots showing the interaction effect of the optimization parameters on the yield of ODPs

2.3響應面圖分析

將模型中的某一因素固定在零水平作響應面圖可獲得另外兩個因素的交互作用圖。圖形的響應曲面及其等高線圖的形狀可以反映交互效應的強弱（如圖4所示）。響應面圖的拋物面開口向下，且具有極大值點，說明所選因素水平里包括了最優(yōu)組合[22]。等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則說明交互作用不顯著。如圖4（c）所示，料液比與提取時間直接的交互作用對ODPs的影響顯著，此外，兩者的曲面圖較陡峭，說明隨著料液比與提取時間的增加，ODPs的得率增加，但到了極值之后，兩因素的增加反而會使得率下降。響應面圖分析結果與單因素分析，以及模型方差分析結果具有一致性。

軟件分析所得最佳提取條件為，提取溫度93.04℃、提取時間3.43h、液料比61.6∶1（mL/g），在此條件下，ODPs的理論得率可達到25.14%?？紤]實際的操作性，就將提取工藝修正為：提取溫度93℃、提取時間3.5h、水料比62∶1mL/g。

2.4驗證實驗

為了檢驗模型的準確性，在修正的優(yōu)化條件（提取溫度93℃、提取時間3.5h、水料比62∶1mL/g）下進行了3次提取實驗，所得ODPs分別為25.09%、25.01%、25.04%，平均值為25.05%，與模型預測值25.14%較接近，表明該模型能較好的預測實際的提取情況。

圖5　提取溫度對ODPs清除DPPH自由基活性的影響Fig.5　Effect of temperature on the scavenging of ODPs for DPPH·

2.5提取溫度對ODPs清除DPPH自由基活性及蛋白質含量的影響

有研究[23]顯示，高溫提取的香菇多糖，雖然在提取前3h，DPPH·清除率下降，但之后抗氧化活性增強，而且超過新鮮香菇的清除能力，分析原因可能為加熱過程中生成了具有抗氧化活性的美拉德反應產物。孫世利[24]的研究則顯示，60～70℃提取的茶多糖抗氧化性最強。這些研究提示溫度可能會改變多糖的抗氧化活性。于是本文研究了不同提取溫度下ODPs的DPPH·抗氧化活性。結果如圖5所示，隨著多糖濃度的增加，ODPs對DPPH·的清除能力增加，ODPs具有一定的抗氧化性。對比從60～100℃之間的幾個溫度水平，高溫的兩個水平（95、100℃）所得ODPs的DPPH·清除能力較高，而溫度較低的幾個水平（60、70、80、90℃）所得的ODPs的DPPH·清除率相對較低。而且，隨著多糖濃度的增加，抗氧化性的差別越明顯。當ODPs濃度為6.4mg/mL時，對不同溫度提取的ODPs對DPPH·的清除率作單因素方差分析，結果顯示，它們對DPPH·的清除率具有顯著性差異（p＜0.05）。結合圖1、圖5及圖6可以發(fā)現，在所設置的溫度范圍內，95℃條件下的ODPs的DPPH·清除率最高、ODPs含量最高，蛋白質含量也最高，且與較低的提取溫度（60、70、80、90℃）相比，均具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。提示本實驗優(yōu)化條件所得的ODPs不僅可以提高得率及純度，還增加了其抗氧化能力。

圖6　提取溫度對ODPs蛋白質含量的影響Fig.6　Effect of temperature on the protein content of crude extracts

3　結論

通過響應面實驗設計使ODPs得率增加，驗證實驗結果達到25.04%，與預測值較接近，說明模型優(yōu)化成功。修正后最佳提取條件為溫度93℃，液料比62∶1（mL/g），時間3.5h。響應面結果分析提示提取時間對多糖得率影響最大，其次是提取溫度和液料比。提取溫度不僅顯著影響ODPs得率，還影響其抗氧化活性，95℃下提取所得的ODPs含量、DPPH·清除能力都最強，但多糖中蛋白質含量也最高。說明通過提取工藝的優(yōu)化，尤其是提取溫度的控制，可以獲得較高的多糖得率及較強的活性。

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Optimization of extraction conditions of Opuntia dillenii Haw. polysaccharides by response surface analysis and their antioxidant activity study

LI Heng1，LI Li-mei2，HE Chun-mei1，ZHU Miao1，ZHOU Xian-jiao1，ZENG Fu-hua1，*
（1.College of Life Science and Technology，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，China；2.University Engineering＆Technology Development Center of Fringe Tropical Characteristic Plant in Guangdong，Zhanjiang 524048，China）

This study examined the extraction conditions of Opuntia dillenii Haw.Polysaccharides（ODPs）with a series of methods.Firstly，based on the single-factor tests，response surface methodology was used to investigate the effect of three parameters（liquid-materal ratio，extraction time，exraction temperature）on the ODPs yields. Secondly，a second-order polynomial regression model was established using a Box-Behnken experimental design.Finally，the DPPH·scavenging and protein content of ODPs was measured.Consequently，the exraction temperature，liquid-material ratio，extraction time were the major factor affecting the exraction rate of ODPs with a very low p-values（p＜0.001）.The polysaccharides and protein content of ODPs and the DPPH·scavenging of ODPs were the highest under the 95℃ extraction temperature.The optimal conditions exhibited a liquidmateral ratio 62∶1，extraction time 3.5h and exraction temperature 93℃.Under these conditions，the actual extraction rate of ODPs was 25.05%，while the predicted value was 25.14%.In conclusion，the conditions optimization by the response surface method were better for enhanced the extraction rate，and the exraction temperature of 95℃was better for the antioxidant activity of ODPs.

Opuntia dillenii Haw.；polysaccharides；extraction；response surface methodology；antioxidant activity

TS255.1

B

1002-0306（2015）04-0210-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.037

2014－06－18

李恒（1980-），女，碩士，講師，研究方向：天然產物研究與開發(fā)。

曾富華（1952-），男，博士，教授，研究方向：天然產物研究與開發(fā)。

國家星火計劃（2013GA780085，2013GA780082，2012GA780016）；廣東省科技計劃項目（2013B010404047）；湛江市科技攻關計劃項目（2014A01012，2014A02012，2012C030304）。