張首玉，周婧琦，李少華，孫　艷，高愿軍

（1.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹飪食品系，河南鄭州450046；2.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南漯河463200；3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

秋葵多糖與α-淀粉酶的相互作用及光譜學(xué)分析

張首玉1，周婧琦2，李少華1，孫艷2，高愿軍3，*

（1.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹飪食品系，河南鄭州450046；2.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南漯河463200；3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

研究秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用，并運(yùn)用紫外光譜對(duì)其相互作用的光譜進(jìn)行探討，結(jié)果表明，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制性，且隨其濃度的增加而增強(qiáng)，其抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)可逆型。經(jīng)過紫外光譜分析表明，隨著秋葵多糖濃度的不斷增加其吸收峰逐漸增強(qiáng)且發(fā)生藍(lán)移，證明秋葵多糖與α-淀粉酶混合時(shí)彼此之間發(fā)生了作用。

秋葵多糖，淀粉酶，抑制作用，光譜

秋葵富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、多糖、黃酮類等化合物，屬于低脂肪、低熱量、無膽固醇的食藥兩用營(yíng)養(yǎng)保健新型蔬菜，具有極高的藥用保健功能，如降血糖、抗疲勞、利尿、健胃、抗菌、抗氧化、抗誘變止血等[1]。作為一種天然的藥物資源，秋葵在食品以及保健品行業(yè)具有著廣闊的開發(fā)前景。

多糖作為秋葵的功能成分之一與其具有的部分生物活性有著密切的聯(lián)系，已有研究證實(shí)，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖C57BL/6小鼠，秋葵可以降低其血糖和血脂。α-淀粉酶是一種與糖脂代謝密切相關(guān)的酶類，對(duì)α-淀粉酶抑制作用的研究是探討降糖降脂作用機(jī)理的有效手段之一[2]。經(jīng)研究顯示，α-淀粉酶抑制劑屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種，它能有效抑制唾液淀粉酶和胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的消化吸收，從而起到降低血糖和血脂的作用[2]，但關(guān)于秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制效應(yīng)還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制機(jī)理，為進(jìn)一步研究秋葵多糖的降糖降脂效應(yīng)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

秋葵市售；α-淀粉酶、阿卡波糖生化試劑；無水乙醇、鹽酸、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、丙酮、氯化鈉分析純。

AL240電子天平梅特勒-托里儀器有限公司（上海）；UV-200紫外分光光度計(jì)龍尼柯儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；SHZ-6循環(huán)水式多用真空泵河南省英峪中華儀器廠；PHS-3C酸度計(jì)上海理達(dá)儀器廠；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；HC-3618R高速冷凍離心機(jī)安徽中科科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1秋葵多糖的制備[3]用蒸餾水清洗新鮮秋葵嫩莢，將其放于冷凍干燥機(jī)-80℃干燥后磨成粉狀。采用纖維素酶的方法浸提，用80%的無水乙醇4℃冷藏醇沉過夜，離心收集沉淀，運(yùn)用Sevage法脫除蛋白，經(jīng)大孔樹脂AB-8進(jìn)一步純化，冷凍干燥得秋葵多糖（RPS1）備用。

1.2.2酶活力的測(cè)定方法參考國(guó)標(biāo)GB 8275-2009對(duì)樣液進(jìn)行配制[4]，采用碘-淀粉呈色法測(cè)定。

取α-淀粉酶和秋葵多糖溶液各0.5mL將其混勻，在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min，加入可溶性淀粉溶液1mL，再在水浴鍋中預(yù)熱15min后用濃度為2mol/L的鹽酸溶液0.3mL中止反應(yīng)，用4mL蒸餾水稀釋搖勻，立即將反應(yīng)液加入到預(yù)先盛有0.2mL稀碘液的試管中，搖勻，以不加多糖溶液作為空白對(duì)照，在660nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值。根據(jù)式（1）計(jì)算樣品的酶活力。

式中：X—樣品酶活力，U/mg；c—測(cè)試的樣液濃度，mg/mL；n—加入抑制劑體積，mL。

1.2.3淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/mL質(zhì)量濃度的可溶性淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，在試管內(nèi)分別加入上述標(biāo)液1mL置于37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min，再在水浴鍋中預(yù)熱15min后用濃度為2mol/L的鹽酸溶液0.3mL中止反應(yīng)，用4mL蒸餾水稀釋搖勻，立即將反應(yīng)液加入到預(yù)先盛有0.2mL稀碘液的試管中，搖勻，以蒸餾水作為空白對(duì)照，在660nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，以可溶性淀粉質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，吸光值作為縱坐標(biāo)，繪制可溶性淀粉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4秋葵多糖濃度對(duì)α-淀粉酶抑制效應(yīng)的影響

以阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。分別稱取不同質(zhì)量純化后的秋葵多糖和阿卡波糖配制成不同濃度的溶液，運(yùn)用1.2.2酶活力的測(cè)定方法測(cè)量其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制影響，抑制率的計(jì)算如式（2）所示。

式中，I—抑制率，%；T1—抑制劑活力，U/mg；T2—酶活力，U/mg。

1.2.5秋葵多糖與α-淀粉酶作用時(shí)間對(duì)酶抑制效應(yīng)的影響分別在秋葵多糖濃度0.5mg/mL和阿卡波糖濃度0.35mg/mL下，與α-淀粉酶作用不同的時(shí)間，根據(jù)1.2.2酶活力的測(cè)定方法，在pH為7室溫條件下測(cè)定其OD值，計(jì)算抑制率，研究秋葵多糖對(duì)酶抑制活性的影響。

1.2.6不同pH條件下秋葵多糖對(duì)酶活性的抑制影響

秋葵多糖濃度0.5mg/mL，以阿卡波糖（0.35mg/mL）作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，室溫下靜置5min，根據(jù)1.2.2酶活力的測(cè)定方法，研究不同pH對(duì)酶活性的抑制影響。

1.2.7秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶抑制效應(yīng)的研究固定底物的濃度為0.5mg/mL的α-淀粉酶，分別加入其質(zhì)量為0、10、20、30、40、50μL，根據(jù)1.2.2酶活力的測(cè)定方法，研究不同濃度下的秋葵多糖抑制α-淀粉酶酶活力隨底物濃度的變化情況，以α-淀粉酶的加入量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制抑制效應(yīng)曲線。

1.2.8秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶抑制類型的研究根據(jù)1.2.2酶活力的測(cè)定方法，加入定量50μL的α-淀粉酶，改變其質(zhì)量濃度，研究不同濃度下秋葵多糖的酶活力隨底物濃度的變化規(guī)律，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，繪制秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)曲線，判斷其抑制類型。

1.2.9秋葵多糖與α-淀粉酶相互作用的紫外光譜分析根據(jù)抑制作用強(qiáng)、中、弱分別取秋葵多糖溶液濃度0.1、0.45、0.6mg/mL與α-淀粉酶混勻置于37℃恒溫水浴鍋中15min，在波長(zhǎng)為180～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中的圖表均采用Excel、SPSS軟件進(jìn)行了處理與分析，每處理重復(fù)3次。

2　結(jié)果與討論

2.1淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

可溶性淀粉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

從圖1可以看出，回歸方程為y=1.2556x+0.0214（R2=0.9966），說明淀粉質(zhì)量濃度在0.1～0.7mg/mL區(qū)間線性關(guān)系良好。根據(jù)淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得酶活力的計(jì)算公式如式（3）所示。

式中：OD1—加入抑制劑后的吸光值；OD2—只加α-淀粉酶時(shí)的吸光值；n—所加抑制劑體積，mL。

2.2秋葵多糖濃度對(duì)α-淀粉酶抑制效應(yīng)的影響

不同濃度的秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制率見圖2。

從圖2可以看出，作為陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制作用，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶也具有一定的抑制作用，但抑制率低于阿卡波糖，在0.1～0.5mg/mL濃度范圍內(nèi)，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，隨其濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)多糖溶液的濃度達(dá)到0.5mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到約80%且趨于恒定。

圖2　秋葵多糖濃度對(duì)酶抑制效應(yīng)的影響Fig.2　Effect of okra polysaccharide with different concentration on the inhibiting activity of enzyme

2.3秋葵多糖與α-淀粉酶作用時(shí)間對(duì)酶抑制效應(yīng)的影響

根據(jù)圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別配制其最大抑制率濃度依次為阿卡波糖溶液濃度0.35mg/mL和秋葵多糖溶液濃度0.5mg/mL，研究它們各自與α-淀粉酶反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)其抑制率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　秋葵多糖與酶作用時(shí)間對(duì)酶抑制效應(yīng)的影響Fig.3　Effect of different reaction time on the inhibiting activity of enzyme

由圖3可知，作為陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的阿卡波糖在5min內(nèi)，抑制率就達(dá)到了82%，說明其在短時(shí)間內(nèi)能與α-淀粉酶迅速有效地結(jié)合，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制性。而秋葵多糖與α-淀粉酶的結(jié)合能力明顯低于阿卡波糖，當(dāng)抑制率達(dá)到78%時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制率基本處于穩(wěn)定，所需時(shí)間約15min。由此可知，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶具有一定的抑制作用，但其作用時(shí)間較長(zhǎng)，抑制能力低于阿卡波糖。

2.4不同pH條件下秋葵多糖對(duì)酶活性的抑制影響

分別配制阿卡波糖溶液濃度0.35mg/mL和秋葵多糖溶液濃度0.5mg/mL，研究它們?cè)诓煌琾H條件下對(duì)α-淀粉酶活性的抑制影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，對(duì)照實(shí)驗(yàn)阿卡波糖在不同pH條件下對(duì)α-淀粉酶的量效曲線基本接近直線，因此在酸堿環(huán)境下呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。秋葵多糖在pH1～6范圍內(nèi)，對(duì)α-淀粉酶的抑制作用相對(duì)穩(wěn)定，抑制率一直保持在一恒定的范圍；當(dāng)pH7～12時(shí)，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用逐漸減弱，抑制率不斷降低?？梢?，秋葵多糖在酸性環(huán)境下對(duì)α-淀粉酶表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制活性，但在堿性環(huán)境中，抑制作用有所下降。

圖4　不同pH條件秋葵多糖對(duì)酶抑制效應(yīng)的影響Fig.4　Effect of pH on the inhibiting activity of enzyme

2.5秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶抑制效應(yīng)的影響

判定對(duì)酶的抑制作用類型可逆與否，除了用透析、超濾或凝膠過濾等物理方法看能否除去抑制劑來區(qū)別外，還可以采用酶抑制動(dòng)力學(xué)方法判斷[5]。以加酶量分別為0、10、20、30、40、50μL的條件下，根據(jù)1.2.2酶活力的測(cè)定方法，研究不同抑制作用強(qiáng)度的秋葵多糖（0、0.45、1mg/mL）時(shí)對(duì)α-淀粉酶的抑制率，判斷其抑制效應(yīng)，結(jié)果見圖5。

圖5　秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制效應(yīng)Fig.5　The depression effect of α-amylase by okra polysaccharide

從圖5可以看出，α-淀粉酶加酶量與其攝入后OD值作圖得到一系列通過原點(diǎn)的直線，隨著秋葵多糖濃度的增加，其直線斜率逐漸降低，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶活力的抑制作用不斷加強(qiáng)，符合可逆抑制作用的特點(diǎn)[6]。所以，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制類型屬于可逆抑制。

2.6秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶抑制類型的動(dòng)力學(xué)測(cè)定

將濃度分別為0、0.25、1mg/mL的秋葵多糖溶液作為α-淀粉酶的抑制劑[S]，測(cè)定不同底物濃度的α-淀粉酶酶促反應(yīng)的抑制速率[V]即OD值。以1/[S]作為橫坐標(biāo)，1/[V]作為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線，如圖6所示。

從圖6可以看出，3條不同質(zhì)量濃度的秋葵多糖溶液對(duì)α-淀粉酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)曲線均為不通過原點(diǎn)的直線，當(dāng)加入秋葵多糖抑制劑后，抑制速率V并未發(fā)生很大的變化，但隨著所需底物濃度明顯地增加，其抑制速率逐漸增大，即米氏常數(shù)Km增大，其抑制機(jī)理呈現(xiàn)出典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，說明秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。由于秋葵多糖屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，又與酶的結(jié)合是可逆的，因而可通過增加底物濃度，提高底物競(jìng)爭(zhēng)力的辦法，消除競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抑制作用，從而使酶促反應(yīng)速率接近或達(dá)到最大值。

圖6　秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶抑制類型的動(dòng)力學(xué)分析Fig.6　The kinetic analysis of inhibition type on α-amylase by okra polysaccharide

2.7秋葵多糖與α-淀粉酶相互作用的紫外光譜分析

將不同濃度的秋葵多糖與α-淀粉酶混勻置于37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15min，在波長(zhǎng)為180～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖7。

圖7　秋葵多糖與α-淀粉酶的紫外光譜分析Fig.7　The UV spectra of okra polysaccharide and α-amylase

由圖7可知，α-淀粉酶在290nm附近有紫外吸收峰，這主要是由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）光吸收以及與酶構(gòu)象和螺旋有關(guān)的相互作用所引起[7-8]。隨著秋葵多糖濃度的不斷增加，其吸收峰逐漸增強(qiáng)且發(fā)生藍(lán)移。這說明秋葵多糖與α-淀粉酶混合時(shí)相互之間發(fā)生了作用，改變了酶分子中Trp和Tyr所處空間結(jié)構(gòu)的微環(huán)境，從而引起了α-淀粉酶最大紫外吸收波長(zhǎng)和強(qiáng)度的改變[9]，使其構(gòu)象發(fā)生了改變。

3　結(jié)論

秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用弱于阿卡波糖，但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，且隨其濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)溶液濃度達(dá)到0.5mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到80%。此外，秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的作用時(shí)間較長(zhǎng)，抑制能力略低于阿卡波糖。秋葵多糖在酸堿環(huán)境下均表現(xiàn)出了較好的劑量依賴性，在酸性環(huán)境下其對(duì)α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制作用，但在堿性環(huán)境中，其抑制作用有所下降。秋葵多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)可逆型。通過紫外光譜分析，隨著秋葵多糖濃度的增加，其吸收峰逐漸增強(qiáng)且發(fā)生藍(lán)移，說明秋葵多糖與α-淀粉酶之間發(fā)生了作用。

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Effect of okra polysaccharide on α-amylase inhibition and its spectral analysis

ZHANG Shou-yu1，ZHOU Jing-qi2，LI Shao-hua1，SUN Yan2，GAO Yuan-jun3，*
（1.Department of Tourism＆Cooking，Henan Polytechnic，Zhengzhou 450046，China；2.Luohe Food Vocational College，Luohe 463200，China；3.College of Food and Biology Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China）

The effects of okra polysaccharide on α-amylase and its UV spectra were studied in the test.The results showed that okra polysaccharide had strong inhibition ability on α-amylase，the increase of its concentration，and could lead to reversible competitive inhibition.Moreover，UV spectra showed that okra polysaccharide induced a blue shift of α-amylase warelength，and increased with the increase of its concentration.These results provided that interaction occured when mixed between the okra polysaccharide and α-amylase.

okra polysaccharide；α-amylase；inhibition；UV spectra

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0101-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.013

2014－05－26

張首玉（1972-），女，本科，副教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)及食品安全。

高愿軍（1957-），男，博士，教授，研究方向：果蔬加工與貯藏。

漯河市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014071）。