高 妍 李靜輝 方珍珍 程鎮(zhèn)燕 喬秀亭 白東清

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384)

糖是魚(yú)類最廉價(jià)的無(wú)氮供能物質(zhì)［1］，飼料中糖水平會(huì)影響魚(yú)類的生長(zhǎng)和體內(nèi)相關(guān)代謝活動(dòng)，可起到節(jié)約蛋白質(zhì)的作用［2］?，F(xiàn)有研究表明，肉食性魚(yú)類如翹嘴紅鲌攝食低糖水平飼料后能夠達(dá)到最大生長(zhǎng)［3］。草食性魚(yú)類如草魚(yú)則能夠耐受飼料中較高水平的［4］。多糖和寡糖通常比二糖和單糖更容易被魚(yú)類吸收利用［5-6］。

烏克蘭鱗鯉(Cyprinus carpio)，又名俄羅斯鯉，是我國(guó)引進(jìn)的養(yǎng)殖品種［7］，與普通鯉魚(yú)相比生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗病力強(qiáng)、出肉率高［8］。目前有關(guān)飼料糖水平對(duì)烏克蘭鱗鯉生長(zhǎng)，消化酶活性和糖代謝的影響還未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究以糊精為糖源，設(shè)計(jì)不同糖水平飼料，養(yǎng)殖8周后，測(cè)定肝胰臟和腸道中的消化酶活性、血清和肝胰臟中糖代謝酶活性以及肝胰臟和腸道中代謝酶的表達(dá)量，旨在探討飼料糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉生長(zhǎng)、消化和糖代謝的影響，為雜食性魚(yú)類飼料研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

烏克蘭鱗鯉購(gòu)自天津市西青區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，運(yùn)至天津農(nóng)學(xué)院校內(nèi)實(shí)踐基地，用商業(yè)飼料(粗蛋白質(zhì)32%，粗脂肪≥10%，粗灰分15.0%，鈣0.5% ～1.5%，總磷 0.7%)馴化 1周后，挑選體表無(wú)外傷、健康活潑、大小均勻的幼魚(yú)隨機(jī)分配于6個(gè)方形塑料箱(78 cm×58 cm×46 cm)內(nèi)。將塑料箱隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)重復(fù)(塑料箱)，每個(gè)重復(fù)50尾試驗(yàn)魚(yú)，試驗(yàn)魚(yú)平均體重為3.92 g，平均體長(zhǎng)為6.44 cm。以魚(yú)粉、豆粕、酪蛋白、花生粕、棉籽粕、菜籽粕為蛋白質(zhì)源，大豆油為脂肪源，糊精為糖源，配制糖水平分別為15%和25%，蛋白質(zhì)水平為30%的2種試驗(yàn)飼料。所有飼料原料均過(guò)80目篩，原料逐級(jí)放大混勻后，用雙螺桿制粒機(jī)制成顆粒飼料，飼料自然風(fēng)干后保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。粗蛋白質(zhì)含量采用ThermoFisher scientific FLASH-2000全自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定，粗脂肪含量采用Gerhadt Soxtherm索氏浸提系統(tǒng)測(cè)定。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間水溫為29～31℃，溶氧濃度 ＞6 mg/L，氨氮含量≤0.05 mg/L，自然光照，并連續(xù)充氣。投飼率為體重的3% ～4%，每日投喂時(shí)間為08:30和15:30，投餌1 h后，用虹吸法吸去排泄物，換水1/3～1/2，養(yǎng)殖時(shí)間為8周。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)結(jié)束后，禁食48 h，逐箱稱重，隨機(jī)從每箱取10尾魚(yú)，從尾靜脈采血，并以4 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，制得血清樣品。采完血樣的魚(yú)，立即在冰上解剖，取肝胰臟及前腸、中腸、后腸。血清和組織樣品在液氮中速凍后，轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱中保存，待測(cè)。

余下的魚(yú)禁食48 h后，進(jìn)行再投喂，之后在0、3、6、12、24、48 h 時(shí)取其肝胰臟和全腸液氮速凍后，轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱中保存，用于糖代謝酶基因表達(dá)的測(cè)定。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.5 生化指標(biāo)的測(cè)定

肝胰臟、腸道解凍后用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重。組織與預(yù)冷的生理鹽水按1∶9的比例冰浴勻漿，然后在4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液待測(cè)。脂肪酶(lipase，LPS)所用粗酶液制備時(shí)組織與預(yù)冷生理鹽水按1∶4的比例冰浴勻漿。

組織中蛋白質(zhì)含量(A045-2)，血清中葡萄糖(F006)、甘油三酯(F001-2)和膽固醇(F002-2)含量，肝胰臟和腸道中淀粉酶(amylase，AMS)(C016)、LPS(A054)活性，肝糖元(A03)、肌糖元(A03)含量由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。胰蛋白酶(trypsin，TRY)活性測(cè)定采用福林酚法［9］。

1.6 糖代謝酶活性的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定的指標(biāo)如下:己糖激酶(HK)(A077)、丙酮酸激酶(PK)(A076)、蘋果酸脫氫酶(MDH)(A021)。采用上海通蔚生物公司試劑盒測(cè)定的指標(biāo)有:葡萄糖激酶(GK)(ml025826)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)(ml025824)。

1.7 糖代謝酶基因表達(dá)的分析

1.7.1 總RNA的提取及cDNA第1鏈合成

采用 RNAiso Plus(9108，TaKaRa公司)提取烏克蘭鱗鯉的總RNA。試驗(yàn)用的所有離心管、槍頭等用具均經(jīng)過(guò)去RNA酶處理，再經(jīng)過(guò)高溫高壓處理后烘干備用。提取操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)所示步驟操作。使用PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit(6110A，TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)所示步驟進(jìn)行。

1.7.2 GK和G6Pase mRNA表達(dá)的半定量分析

GK［10］和 G6Pase［11］引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成?；讦?肌動(dòng)蛋白(β-actin)的mRNA水平在多數(shù)器官組織中穩(wěn)定表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參基因。以烏克蘭鱗鯉肝胰臟、腸道的cDNA為模板，采用rTaq DNA聚合酶(DRR001A，TaKaRa公司)以上述引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL，含 10×PCR Buffer、GK上游引物(10μmol/L)或 G6Pase上游引物(20μmol/L)，GK 下 游 引 物(10 μmol/L)或G6Pase下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL，rTaq酶、cDNA 1μL。95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，59 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。β-actin基因片段的擴(kuò)增除引物為β-actin上游引物和下游引物［12］外，其余均與上述反應(yīng)相同。根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物量的比值計(jì)算樣品中GK和G6Pase mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法，組間試驗(yàn)數(shù)據(jù)用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性比較。同組不同時(shí)間段基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，用Duncan氏法多重檢驗(yàn)分析試驗(yàn)結(jié)果平均值的顯著性，結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉生長(zhǎng)的影響

如表2所示，25%糊精組的SGR顯著高于15%組(P＜0.05)。25% 糊精組的 PER、CF和HSI均高于15%糊精組，但差異不顯著(P＞0.05)。25%糊精組的FCR低于15%糊精組，但差異不顯著(P ＞0.05)。

表2 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of dietary dextrin level on growth of Ukraine scaly carp(Cyprinus carpio)

2.2 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉肝糖元、肌糖元及血清甘油三酯、膽固醇、葡萄糖含量的影響

如表3所示，25%糊精組的肝糖元含量高于15%組，而肌糖元含量則低于15%糊精組，但差異均未達(dá)顯著水平(P＞0.05)。25%糊精組的血清甘油三酯、膽固醇和葡萄糖含量顯著高于15%糊精組(P ＜0.05)。

表3 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉糖元、甘油三酯、膽固醇和葡萄糖含量的影響Table 3 Effects of dietary dextrin level on glycogen，triglycetride，cholesterol and glucose contentsof Ukraine scaly carp(Cyprinus carpio)

2.3 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉消化酶活性的影響

如表4所示，15%糊精組肝胰臟、前腸、中腸AMS活性顯著高于 25%糊精組(P＜0.05)。15%糊精組前腸和后腸LPS活性顯著高于25%糊精組(P＜0.05)。15%糊精組肝胰臟、前腸、中腸TRY活性均顯著高于25%糊精組(P＜0.05)，而后腸TRY活性則顯著低于25%糊精組(P＜0.05)。

表4 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉消化酶活性的影響Table 4 Effects of dietary dextrin levels on digestive enzyme activities of Ukraine scaly carp(Cyprinus carpio) U/g prot

2.4 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉糖代謝酶活性的影響

如表5所示，25%糊精組血清和肝胰臟HK和GK活性顯著高于15%糊精組(P＜0.05)。25%糊精組血清PK和MDH活性顯著高于15%糊精組(P＜0.05)。25%糊精組肝胰臟MDH活性顯著低于15%糊精組(P＜0.05)，而肝胰臟G6Pase活性與之相反，顯著高于15%糊精組(P＜0.05)。

2.5 禁食再投喂后飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉糖代謝酶基因表達(dá)的影響

如表6所示，從禁食48 h到再投喂48 h，2組試驗(yàn)魚(yú)肝胰臟中GK mRNA的表達(dá)量均是先升高后降低的趨勢(shì)，在12 h時(shí)，表達(dá)豐度達(dá)到最高。其中12 h時(shí)15%糊精組GK mRNA的表達(dá)量顯著高于0、3、6、24和48 h時(shí)(P＜0.05);而12 h時(shí)25%糊精組GK mRNA的表達(dá)量顯著高于0、3、6和48 h時(shí)(P ＜0.05)，且12 h 時(shí)GK mRNA的表達(dá)量是48 h時(shí)的3.5倍左右。在24 h時(shí)25%糊精組GK mRNA的表達(dá)量顯著高于15%糊精組(P＜0.05)。由此可見(jiàn)，提高飼料中糊精水平雖能誘導(dǎo)肝胰臟 中GK基因的表達(dá)，但效果并不太明顯。

表5 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉糖代謝酶活性的影響Table 5 Effects of dietary dextrin level on carbohydrate metabolism enzyme activities of Ukraine scaly carp(Cyprinus carpio)

GK mRNA的表達(dá)量在腸道中隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與在肝胰臟中相似，但在腸道中25%糊精組GK mRNA的表達(dá)量低于15%糊精組，并在12 h時(shí)有顯著差異(P＜0.05)，其他各時(shí)間段均無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。在12 h時(shí)GK mRNA的表達(dá)量顯著高于3、48 h時(shí)(P ＜0.05)，與6、24 h時(shí)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。由此可見(jiàn)，飼料中糊精水平的提高并未誘導(dǎo)魚(yú)類腸道中GK基因的表達(dá)，反而在低糊精水平時(shí)GK基因的表達(dá)更高些。

表6 禁食再投喂后飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉GK mRNA表達(dá)的影響Table 6 Effects of dietary dextrin level on GK mRNA expression level of Ukraine scaly carp(Cyprinus carpio)after fasting and refeeding

如表7所示，從禁食48 h到再投喂48 h，2組試驗(yàn)魚(yú)肝胰臟G6Pase mRNA的表達(dá)量變化趨勢(shì)均是先升高后降低，25%糊精組在6 h時(shí)達(dá)到最大值，15%糊精組在24 h時(shí)達(dá)到最大值，均顯著高于同一糊精水平其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量(P＜0.05)。在3和6 h時(shí)，2組試驗(yàn)魚(yú)肝胰臟G6Pase mRNA的表達(dá)量有顯著差異(P ＜0.05)。

腸道中2組試驗(yàn)魚(yú)G6Pase mRNA的表達(dá)量變化趨勢(shì)與在肝胰臟中相同，均是先升高后降低，且都在24 h時(shí)達(dá)到最大值。各時(shí)間點(diǎn)25%糊精組腸道中G6Pase mRNA的表達(dá)量均高于15%糊精組，但差異不顯著(P ＞0.05)。

表7 禁食再投喂后飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉G6Pase mRNA表達(dá)量的影響Table 7 Effects of dietary dextrin level on G6Pase mRNA expression level of Ukraine scaly carp(Cyprinus carpio)after fasting and refeeding

3 討論

3.1 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉生長(zhǎng)的影響

雜食性魚(yú)類對(duì)糊精的利用能力要好于葡萄糖［13］，因此本試驗(yàn)選用糊精作為烏克蘭鱗鯉飼料中糖的主要來(lái)源。本研究結(jié)果表明，在飼料蛋白質(zhì)水平為30%時(shí)，25%糊精組SGR顯著高于15%糊精組，說(shuō)明提高飼料中糖水平能夠促進(jìn)烏克蘭鱗鯉的生長(zhǎng)，對(duì)飼料中的蛋白質(zhì)有節(jié)約作用。魚(yú)類由糖類合成脂肪的場(chǎng)所主要位于肝臟［14］，本試驗(yàn)中25%糊精組HSI高于15%糊精組，可能原因是糖類在魚(yú)體內(nèi)轉(zhuǎn)化成脂肪，蓄積在肝胰臟導(dǎo)致肝體指數(shù)上升。

飼料中的糖類除被魚(yú)體氧化分解供能外，還可轉(zhuǎn)化合成糖元或通過(guò)磷酸戊糖途徑提供合成脂肪的材料［2］。本試驗(yàn)中，飼料中糊精水平對(duì)肝糖元和肌糖元含量無(wú)顯著影響，但25%糊精組血清甘油三酯、膽固醇和葡萄糖含量均顯著高于15%糊精組，說(shuō)明提高飼料中糖水平可以促進(jìn)魚(yú)體內(nèi)糖代謝和脂肪合成過(guò)程。

3.2 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉消化酶活性的影響

消化酶是指由消化系統(tǒng)和消化腺分泌的，起營(yíng)養(yǎng)消化作用的酶類，消化酶活性大小與食物組成比例有一定的關(guān)系［15］。AMS是把淀粉分解成糖的碳水化合物分解酶［16］。TRY在蛋白質(zhì)分解中起到重要作用，在幽門盲腸細(xì)胞中合成無(wú)活性的胰蛋白酶原，分泌到腸腔后被內(nèi)切蛋白酶激活［17］。

本試驗(yàn)中，15%糊精組各組織消化酶活性均高于25%糊精組，并且肝胰臟中TRY和AMS活性低于腸道中相應(yīng)酶活性，由此可見(jiàn)腸道是烏克蘭鱗鯉蛋白質(zhì)和淀粉的主要消化器官。強(qiáng)俊等［18］研究不同水平糊化玉米淀粉對(duì)奧尼羅非魚(yú)仔稚魚(yú)生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，18%組TRY活性顯著高于24%組，與本研究結(jié)果相近。有研究表明，雜食性魚(yú)類AMS活性與飼料中糖水平呈正相關(guān)［19］，任鳴春等［20］認(rèn)為魚(yú)體大小可能影響飼料中淀粉利用率，大規(guī)格團(tuán)頭魴能夠耐受飼料中較高水平的淀粉，并且能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為能量。而本試驗(yàn)中15%糊精組肝胰臟、前腸和中腸中AMS活性顯著高于25%糊精組，其原因可能與魚(yú)體大小有關(guān)。劉襄河等［13］研究了飼料糊精水平從10%提高至30%對(duì)暗紋東方鲀消化酶活性的影響，結(jié)果表明，肝臟和腸道LPS活性不受飼料糊精水平的影響，但15%糊精組腸道LPS活性高于25%糊精組，這與本研究結(jié)果相似。

3.3 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉糖代謝酶活性的影響

糖酵解和糖異生是魚(yú)體內(nèi)糖代謝的主要途徑。糖酵解的第1步是葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，催化這個(gè)反應(yīng)的酶有HK和GK。HK和GK活性對(duì)維持動(dòng)物體血糖動(dòng)態(tài)平衡，增加對(duì)糖的利用有重要意義［21-22］。PK可催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，丙酮酸可生成乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)。糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的磷酸二羥丙酮可生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油與乙酰CoA是合成甘油三酯的直接原料［23］。MDH普遍存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌中，是生物糖代謝的關(guān)鍵酶之一，能催化蘋果酸和草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)換［24］，草酰乙酸的濃度是決定三羧酸循環(huán)速度的關(guān)鍵因素之一。三羧酸循環(huán)中的一些中間產(chǎn)物是合成氨基酸的前體物質(zhì)。G6Pase作為糖異生途徑的第1個(gè)限速酶，對(duì)氧化6-磷酸葡萄糖去磷酸化生成葡萄糖從而保持血糖的恒定有著重要的作用［25］。

本試驗(yàn)中，25%糊精組血清和肝胰臟HK和GK活性顯著高于15%糊精組，說(shuō)明提高飼料中糖水平可以誘導(dǎo)糖代謝酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)魚(yú)體對(duì)糖的轉(zhuǎn)化利用，這與本試驗(yàn)中25%糊精組血清中甘油三酯和膽固醇含量升高的結(jié)果相互印證。張世亮等［26］研究了不同糖與脂肪比例對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)肝臟糖酵解酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)GK活性隨著飼料糖水平的升高而增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，25%糊精組肝胰臟MDH活性顯著低于15%糊精組，Kumar等［27］研究糊化淀粉和未糊化淀粉對(duì)南亞野鯪三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)時(shí)發(fā)現(xiàn)MDH活性隨淀粉水平的升高而下降，與本研究結(jié)果一致。此外，25%糊精組肝胰臟G6Pase活性顯著高于15%糊精組，有關(guān)飼料營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)魚(yú)體內(nèi)G6Pase活性的影響比較復(fù)雜，存在不同的調(diào)控機(jī)制［28］，對(duì)歐洲舌齒鱸的研究表明飼料中糖水平對(duì)肝臟G6Pase活性無(wú)顯著影響［29］，而飼料高糖水平對(duì)金頭鯛的G6Pase活性有抑制作用［30］。

3.4 飼料中糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉糖代謝酶基因表達(dá)的影響

GK和G6Pase都是糖代謝的關(guān)鍵酶，Polakof等［31］在虹鱒胰腺中的研究中表明高糖組GK的表達(dá)水平高于對(duì)照組，楊瑩等［32］研究了瓦氏黃顙魚(yú)肝臟中GK的表達(dá)情況，結(jié)果表明糖水平能誘導(dǎo)GK基因的表達(dá)，這些均與本研究的結(jié)果相似。在烏克蘭鱗鯉肝胰臟中，GK mRNA的表達(dá)量在25%糊精組要高于15%糊精組，而腸道中的結(jié)果與肝胰臟中相反。再攝食后12 h時(shí)，2組烏克蘭鱗鯉肝胰臟和腸道中GK mRNA的表達(dá)量均達(dá)到最高，這表明在此時(shí)間段，飼料中的糖被充分消化吸收，與戈賢平等［33］在翹嘴紅鲌中的研究結(jié)果相一致。

王廣宇等［11］在對(duì)翹嘴紅鲌的研究中發(fā)現(xiàn)飼料糖水平對(duì)G6Pase的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，這與本試驗(yàn)中 G6Pase的表達(dá)情況相似。Panserat等［34］用含20%碳水化合物的飼料喂食鯉魚(yú)、金頭鯛時(shí)其體內(nèi)的G6Pase表達(dá)量降低，這與本研究結(jié)果相反，雖然本試驗(yàn)中的飼料糊精水平對(duì)腸道G6Pase mRNA的表達(dá)量沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，但隨糊精水平的增加有上升趨勢(shì)。2組烏克蘭鱗鯉肝胰臟中G6Pase mRNA的表達(dá)量達(dá)到最大的時(shí)間不同，且再投喂后3、6 h時(shí)2組的肝胰臟G6Pase mRNA的表達(dá)量有顯著差異。這可能是由于不同的魚(yú)種和組織，其糖代謝調(diào)節(jié)機(jī)制不同，具體還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

綜合分析，在本試驗(yàn)條件下，25%的飼料糊精水平對(duì)烏克蘭鱗鯉生長(zhǎng)和糖代謝的促進(jìn)作用好于15%的飼料糊精水平。

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