辛杭書 劉凱玉 張永根 王明君 李仲玉 王志博 潘春方 李欣新 劉可園

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030)

甲烷是除二氧化碳(CO2)以外最主要的溫室氣體之一。據(jù)政府間氣候變化專門委員會(IPCC)統(tǒng)計，畜牧業(yè)排出的溫室氣體占8% ～10.8%，尤其是反芻動物養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)［1］。而在各種溫室氣體中，甲烷的溫室效應(yīng)潛勢遠大于CO2，但由于其存在時間低于CO2，可以作為優(yōu)先減排對象［2］。研究表明，通過改良飼糧組分可以有效降低反芻動物溫室氣體的排放量，進而減緩環(huán)境惡化的趨勢［3］。

水稻秸稈是反芻動物重要的粗飼料原料之一，加工處理后的水稻秸可以有效減少動物的甲烷排放量。華金玲等［4］研究表明，經(jīng)過青貯和氨化處理的水稻秸稈能顯著降低反芻動物的甲烷排放量。然而，青貯或氨化處理降低甲烷產(chǎn)量的機理如何，是否是通過影響瘤胃微生物區(qū)系這一途徑來實現(xiàn)的，此類研究還鮮有報道。針對這一問題，設(shè)計了本試驗，通過體外產(chǎn)氣法，研究不同處理水稻秸稈(青貯、氨化和堿化)對甲烷生成、瘤胃發(fā)酵模式以及瘤胃微生物區(qū)系的影響，應(yīng)用實時定量PCR(RT-PCR)方法對甲烷生成相關(guān)的微生物群落，如甲烷菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、原蟲、真菌等進行相對定量分析，旨在探究各處理的水稻秸稈對甲烷產(chǎn)生的影響是否通過改變某些微生物區(qū)系來實現(xiàn)的，為生產(chǎn)實踐提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同處理水稻秸稈的制備

由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場提供優(yōu)質(zhì)的水稻秸稈［干物質(zhì)(DM)32%］，切割成為2～3 cm長度后，分別對其進行不同的加工處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)制作5 kg。

青貯秸稈:選用復(fù)合乳酸菌制劑(1×105CFU/g)，按秸稈DM的8%進行噴灑添加，充分混合，使其含水量達到75%(每5 kg秸稈中菌劑水溶液的添加量約為1.4 kg)，在青貯袋中壓實并密封，青貯處理45 d。復(fù)合乳酸菌制劑由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院反芻動物營養(yǎng)實驗室提供，主要由植物乳酸菌(L.plantarum)、布氏乳桿菌(L.buchneri)和干酪乳桿菌(L.casei)構(gòu)成。

氨化秸稈:將新鮮秸稈晾曬至其含水量達到30%，然后將秸稈DM 5%的尿素溶于水中(每5 kg秸稈中尿素水溶液的添加量約為1.4 kg)，均勻地噴灑于秸稈上，使其含水量達到45%，然后裝入塑料袋中并密封，氨化處理30 d。

堿化秸稈:將新鮮秸稈晾曬至其含水量達到30%，取秸稈DM 4%的氫氧化鈉溶于水中(每5 kg秸稈中氫氧化鈉水溶液的添加量約為0.8 kg)，均勻地噴灑于秸稈上，使其含水量達到40%，裝入塑料袋中并密封，堿化處理7 d。

未處理干秸稈:晾曬至風(fēng)干樣，作為對照。

1.2 體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的測定采用 Menke等［5］及Schofield等［6］方法進行。瘤胃液取自3頭裝有永久性瘤胃瘺管的健康奶牛，于晨飼2 h后由瘤胃的不同位點采集瘤胃液，裝入事先預(yù)熱并通入CO2的保溫瓶中，立即蓋嚴(yán)瓶口，迅速返回實驗室。將采集的瘤胃液充分混合后經(jīng)4層紗布過濾(在39℃溫水浴中進行，通入CO2，保持厭氧環(huán)境)，按比例與緩沖液混合后(瘤胃液∶緩沖液=1∶2，體積比)，利用瓶口分配器迅速分裝(30 mL)至已預(yù)熱好，通有CO2并裝有0.200 0 g(DM 基礎(chǔ))發(fā)酵底物的培養(yǎng)瓶中。其中緩沖液參照Menke等［5］的方法進行配制。每個處理設(shè)3個重復(fù)，3個空白(只裝有瘤胃液與緩沖液)。發(fā)酵裝置主體為HZS-H型恒溫水浴搖床，其水浴溫度和振蕩速率均可調(diào);培養(yǎng)單位是用容積約100 mL的培養(yǎng)瓶，其上安裝有帶塑料管的橡皮塞，用于密封培養(yǎng)瓶;塑料管上帶有可調(diào)開關(guān)的三通閥以保證厭氧發(fā)酵環(huán)境;三通閥與醫(yī)用玻璃注射器(可計量容積為50 mL)相連。注射器每次使用之前須洗凈、烘干，然后用少量液體石蠟涂在活塞筒的四周，以防漏氣，并可減少氣體產(chǎn)生過程中活塞向上移動的阻力。記錄 1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、24、32、36、40、48 和 72 h 的產(chǎn)氣量，并在 4、8、12、16、24、48和72 h用氣體樣品袋收集氣體，立即測定甲烷產(chǎn)量［7］。在發(fā)酵24 h后，迅速測定培養(yǎng)液中的pH(sartorius PB－10型酸度計，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，然后取10 mL培養(yǎng)液以測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的含量。甲烷產(chǎn)量及VFA濃度的測定均采用島津GC－2010氣相色譜儀進行，其中甲烷產(chǎn)量測定時的色譜條件為:熱導(dǎo)檢測器(TCD);填充柱TDX－01色譜柱;測定條件為柱溫150℃，檢測器180℃，進樣口溫度180℃;載氣為氮氣(N2)，流速30 mL/min;進樣量200 μL。VFA濃度測定時的色譜條件為:汽化室參數(shù)為載氣 N2，分流比40∶1，進樣量0.4 μL，溫度 220℃;色譜柱參數(shù)為HP-INNOWax毛細管色譜柱恒流模式，流量2.0 mL/min，平均線速度38 cm/s;柱溫箱參數(shù)為程序升溫 120℃(3 min)——10℃/min——180℃(1 min);檢測器參數(shù)為氫氣(H2)流量 40 mL/min，空氣流量 450 mL/min，柱流量+尾吹氣流量45 mL/min，火焰離子檢測器(FID)溫度250℃。另取10 mL培養(yǎng)液快速轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱內(nèi)保存，用于微生物DNA的提取。

1.3 瘤胃微生物總DNA的提取

采用珠磨－十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法［8］提取瘤胃微生物總DNA。提取后，用紫外可見分光光度計測定提取的總DNA濃度和純度，樣品的 OD260nm與 OD280nm比值應(yīng)在 1.6～1.8之間(平均在1.75左右)，且用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總DNA在加樣孔附近呈現(xiàn)一致密亮帶時，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測微生物相對數(shù)量

從瘤胃微生物總DNA中擴增真細菌16S rDNA。PCR反應(yīng)體系:10×緩沖液 2μL，10 mmol/L的 dNTP 0.4 μL，10 μmol/L 的引物各0.8 μL，25 mmol/L 的 MgCl21.6 μL，模板(瘤胃總 DNA)0.4 μL，TaqDNA 聚合酶2 μL，ddH2O 為13.6μL，總體積為20μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃變性7 min;95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 3 min，35個循環(huán);72℃延伸7 min。RT-PCR的引物參照Denman等［9］報道的瘤胃總細菌、甲烷菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和真菌引物序列［表1，由上海生工生物工程(上海)股份有限公司］。所用儀器為ABI7500型RT-PCR儀，RT-PCR的反應(yīng)條件參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立25μL反應(yīng)體系。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR［9］

1.5 計算公式

根據(jù)下面公式將瘤胃微生物相對數(shù)量表示為相對于瘤胃總細菌16S rDNA的百分比:

目標(biāo)菌相對數(shù)量(%)=2－(Ct目標(biāo)菌－Ct總細菌)×100［3］。

式中:Ct目標(biāo)菌為以目標(biāo)菌引物所測的 Ct值，Ct總細菌為以總細菌為引物所得的Ct值。

采用下列模型計算動態(tài)產(chǎn)氣參數(shù):y=B ×［1 － e－c×(t－lag)］。

式中:y為t時間點0.200 0 g底物DM 的產(chǎn)氣量(mL)，B為0.200 0 g底物DM 理論最大產(chǎn)氣量(mL)，c為樣本的產(chǎn)氣速度(h－1)，t為體外培養(yǎng)時間(h)，lag為產(chǎn)氣延滯期(h)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel初步記錄并做簡單處理，利用7500 System Software分析RT-PCR結(jié)果。然后采用SAS 9.1軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并用混合模型(mixed procedure)進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同處理水稻秸稈對72 h產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)量的影響

由表2可知，與未處理的干秸稈相比，不同處理方法可顯著提高秸稈72 h體外培養(yǎng)的產(chǎn)氣量(P＜0.05)，青貯、氨化和堿化處理分別將產(chǎn)氣量提高了 5.62%、9.37%和 21.38%。甲烷產(chǎn)量的變化趨勢與產(chǎn)氣量相似，各處理秸稈的甲烷產(chǎn)量由高到低依次為堿化秸稈、氨化秸稈、青貯秸稈和干秸稈，其中堿化處理效果顯著(P＜0.05)。堿化秸稈的產(chǎn)氣速度最快，顯著高于其他3種秸稈(P＜0.05)。秸稈經(jīng)青貯處理后，其產(chǎn)氣延滯期顯著低于其他3種秸稈(P＜0.05)，干秸稈、氨化秸稈和堿化秸稈之間的差異不顯著(P＞0.05)。在72 h體外培養(yǎng)過程中，產(chǎn)氣量的動態(tài)變化參見圖1，在12 h之前，青貯秸稈產(chǎn)氣量最高，其他由高到低為堿化秸稈、氨化秸稈和干秸稈;而在12 h之后，堿化秸稈的產(chǎn)氣量一直處于最高水平，干秸稈最低，青貯和氨化秸稈居中。甲烷產(chǎn)量的動態(tài)變化趨勢與體外產(chǎn)氣量相似(圖2)。

表2 不同處理水稻秸稈對體外培養(yǎng)72 h產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of different treated rice straws on rumen gas production and methane production after 72 h in vitro incubation

圖1 不同處理水稻秸稈的72 h體外產(chǎn)氣量的動態(tài)變化Fig.1 The dynamic change of gas production of different treated rice straws in 72 h

圖2 不同處理水稻秸稈的72 h體外甲烷產(chǎn)量的動態(tài)變化Fig.2 The dynamic change of methane production of different treated rice straws in 72 h

2.2 不同處理水稻秸稈對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，不同處理方法對水稻秸稈體外培養(yǎng)氨態(tài)氮(NH3-N)濃度有顯著的影響(P＜0.05)，其中氨化秸稈的NH3-N濃度最高，其次為青貯秸稈和堿化秸稈，而干秸稈的NH3-N濃度最低。與未處理的干秸稈相比，不論是青貯、氨化還是堿化，均顯著提高了體外培養(yǎng)的揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度(P＜0.05)，其中青貯秸稈和氨化秸稈顯著提高了丙酸的含量(P＜0.05)，降低了乙酸/丙酸(P＜0.05)，堿化秸稈與干秸稈具有相似乙酸/丙酸(P＞0.05)。而對于甲烷/TVFA而言，氨化秸稈顯著低于干秸稈和堿化秸稈(P＜0.05)。

2.3 不同處理水稻秸稈對瘤胃微生物區(qū)系的影響

由表4可知，與未處理的干秸稈相比，秸稈經(jīng)不同加工處理后，顯著影響了培養(yǎng)液中琥珀酸絲狀桿菌和甲烷菌相對數(shù)量(P＜0.05)，其中氨化和堿化處理顯著提高了瘤胃培養(yǎng)液中琥珀酸絲狀桿菌的相對數(shù)量(P＜0.05)，而氨化處理顯著降低了培養(yǎng)液中甲烷菌的相對數(shù)量(P＜0.05)，但各處理方式對瘤胃培養(yǎng)液中白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、真菌和原蟲的相對數(shù)量沒有顯著影響(P＞0.05)。

由圖5可知，不同處理的秸稈對各時間點的瘤胃微生物區(qū)系有明顯的影響，并且各處理中的各種微生物相對數(shù)量均隨著時間的變化而變化，雖然變化規(guī)律并不是很一致，但均呈現(xiàn)一定的持續(xù)性。其中，各處理的白色瘤胃球菌隨著時間的增加而呈現(xiàn)先升高后下降，再升高再下降的趨勢，但產(chǎn)生變化的時間各點略有不同。黃色瘤胃球菌和真菌則隨著時間的增加而呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在12 h前，青貯秸稈培養(yǎng)液中琥珀酸絲狀桿菌的相對數(shù)量顯著高于干秸稈，其變化趨勢與黃色瘤胃球菌相似。對于甲烷菌而言，各處理后秸稈在12 h前相對穩(wěn)定，而在12 h后，呈現(xiàn)出先增加后下降，而后再增加再下降的趨勢，尤其是青貯秸稈，在12 h前幾乎沒有明顯的變化。各處理秸稈隨著時間的變化對原蟲相對數(shù)量變化趨勢類似，總體趨于增加，但變化幅度很小。

表3 不同處理水稻秸稈對體外培養(yǎng)24 h瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of different treated straws on rumen fermentation parameters after 24 h in vitro incubation

表4 不同處理水稻秸稈體外培養(yǎng)24 h的微生物區(qū)系的影響Table 4 Effects of different treated rice straws on microflora after 24 h in vitro incubation %

3 討論

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是衡量飼料可消化性的重要指標(biāo)之一，而產(chǎn)氣量與營養(yǎng)物質(zhì)的消化率往往呈正相關(guān)性［10］，本試驗選用的3種處理方法均顯著提高了體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量，表明青貯、氨化及堿化均能一定程度上改善水稻秸稈的質(zhì)量，這與前人研究結(jié)果相一致［11－12］。這是由于對秸稈進行處理后，能改變其纖維類成分的相對含量，從而有利于瘤胃微生物的發(fā)酵［13］。而青貯處理后的秸稈，其體外發(fā)酵的產(chǎn)氣延滯期顯著低于其他3種秸稈，這可能由于青貯秸稈含有較高含量的有機酸和乳酸菌，從而縮短了秸稈的發(fā)酵產(chǎn)氣延滯期［14］。

通過青貯、氨化或堿化處理的秸稈的產(chǎn)氣量顯著高于干秸稈，說明此3種處理能有效提高秸稈的消化率。而氨化秸稈的甲烷/TVFA最低，說明甲烷能的損失量降低，這與前人的研究結(jié)果一致［15－16］。Getachew 等［17］通過體外發(fā)酵研究得出，飼料中的慢速降解部分能產(chǎn)生更多的甲烷。水稻秸稈通過氨化處理后，顯著降低了秸稈中性洗滌纖維(NDF)的含量，而NDF是生成乙酸的前體物質(zhì)，所以NDF含量的降低會使瘤胃發(fā)酵模式發(fā)生變化(由乙酸型轉(zhuǎn)向丙酸型發(fā)酵)，進而使參與生成甲烷的底物H2有所減少。

經(jīng)過處理的水稻秸稈體外發(fā)酵后的NH3-N濃度都有明顯的增加，這是由于處理后的秸稈，其發(fā)酵能力提高，進而使粗蛋白質(zhì)的降解速度加快［18］。其中氨化秸稈的培養(yǎng)液NH3-N濃度高于青貯秸稈和堿化秸稈，原因是氨化處理由于添加了氮源，為微生物發(fā)酵提供更多含量的含氮底物來生成NH3-N所致。

圖5 不同處理水稻秸稈對體外培養(yǎng)72 h微生物相對數(shù)量的影響Fig.5 Effects of different treated rice straws on microbe number during 72 h in vitro incubation

VFA是反芻動物能量利用的主要形式，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，這3種酸約占瘤胃發(fā)酵VFA 總產(chǎn)量的95%［19－20］。在本試驗中，3 種不同處理水稻秸稈的試驗組中TVFA濃度均高于干秸稈，這可能由于青貯、青貯和氨化處理可以將秸稈的細胞壁變疏松，有利于微生物的發(fā)酵，進而產(chǎn)生更多的VFA。并且，青貯秸稈和氨化秸稈的乙酸/丙酸有顯著降低，這也進一步表明，這2種處理方法可通過降低乙酸/丙酸來降低甲烷的產(chǎn)量，這與Russell［21］和 Cao 等［16］報道結(jié)果相吻合。

瘤胃中的纖維降解細菌主要有黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌。Fernando等［22］研究發(fā)現(xiàn)在高粗飼糧條件下，琥珀酸絲狀桿菌為瘤胃發(fā)酵中的優(yōu)勢菌群。這與本試驗的研究結(jié)果相似。尿素氨化處理提高了秸稈在瘤胃發(fā)酵中產(chǎn)生的琥珀酸絲狀桿菌相對數(shù)量，這與陳偉健等［23］研究結(jié)果一致。Wanapat等［24］采用RT-PCR技術(shù)進行動物體內(nèi)試驗，發(fā)現(xiàn)氨化處理后的水稻秸稈，顯著提高了瘤胃培養(yǎng)液中白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的數(shù)量。然而，本試驗并未發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，這可能是由于體內(nèi)試驗和體外試驗條件差異原因所產(chǎn)生不同的瘤胃內(nèi)環(huán)境條件所致。在培養(yǎng)前期，青貯秸稈能顯著提高琥珀酸絲狀桿菌的相對數(shù)量，琥珀酸絲狀桿菌在瘤胃發(fā)酵中的主要產(chǎn)物為乙酸和琥珀酸，并不產(chǎn)生H2。所以，青貯處理可能通過促進不產(chǎn)氫菌的生長來降低秸稈發(fā)酵中H2的產(chǎn)生，從而減少甲烷的生成［25］。

真菌在瘤胃纖維降解中同樣發(fā)揮重要的作用。Wood等［26］通過體外研究表明，瘤胃真菌和產(chǎn)甲烷菌對纖維的降解存在促進作用，而甲烷菌的存在能改變瘤胃真菌的活性、改變發(fā)酵產(chǎn)物，使其趨于產(chǎn)生更多的乙酸、甲烷和CO2。本試驗表明，在培養(yǎng)初期，青貯秸稈的培養(yǎng)液中真菌和甲烷菌的相對數(shù)量最低，表明青貯處理不利于甲烷菌和真菌的生長。而真菌相對數(shù)量并不受處理條件的影響。

在16 h前青貯秸稈的培養(yǎng)液中，甲烷菌相對數(shù)量低于其他3種秸稈，這可能是由于青貯秸稈含較高的有機酸，致使甲烷菌的生長受到抑制所致［27］。所以在體外培養(yǎng)初期，青貯秸稈的單位甲烷產(chǎn)量最低。而氨化秸稈降低了24 h體外發(fā)酵甲烷菌的相對數(shù)量，這與瘤胃培養(yǎng)液內(nèi)纖維類物質(zhì)代謝有關(guān)。有研究表明，甲烷菌數(shù)量與秸稈中NDF的含量呈明顯的正相關(guān)性［28］。當(dāng)纖維類物質(zhì)含量低時(如氨化秸稈)，培養(yǎng)底物發(fā)酵能力增強，甲烷生成底物H2的供給量相對充足，從而使甲烷的排放量增多;而對于干秸稈而言，由于纖維類物質(zhì)含量高，通過增加甲烷菌數(shù)量來提高甲烷產(chǎn)量，進而保持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

3種不同處理方法均沒有顯著影響秸稈發(fā)酵中瘤胃原蟲相對數(shù)量，原蟲在瘤胃中以細菌、真菌等為其主要捕食對象［29］，并且與甲烷菌存在共生關(guān)系。因此可以通過驅(qū)除原蟲來減少甲烷菌，進而降低甲烷的排放量［30］。本試驗結(jié)果表明，原蟲相對數(shù)量與甲烷菌變化并不一致。

4 結(jié)論

①對水稻秸稈進行青貯，、氨化和堿化處理，可以不同程度地改變體外瘤胃的發(fā)酵模式，甲烷生成以及瘤胃微生物區(qū)系的組成。

②從甲烷減排角度考慮，可選擇青貯和氨化的處理方式。

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