雷 高 楊 森 夏國慶 陳紅歌*

(1.河南農業(yè)大學生命科學學院，農業(yè)部農業(yè)微生物酶工程重點實驗室，鄭州 450002;2.曼徹斯特大學炎癥與修復研究所，曼徹斯特M13 9PT)

磷壁酸(teichoic acid)和肽聚糖(peptidoglycan)共同構成革蘭氏陽性細菌細胞壁的結構成分，二者構成的細胞壁約占細胞干重的50%［1］。細菌磷壁酸和肽聚糖的研究一直都是研究治療革蘭氏陽性細菌感染疾病的重點。目前已有很多針對肽聚糖結構進行的有關抑菌物質(如溶菌酶、青霉素)及抑菌機制的研究［2-3］，但有關它的磷壁酸降解及抗生素作用的研究卻非常少。磷壁酸是一種富含磷酸基團的線性多聚體，其骨架由磷酸甘油或者磷酸核糖醇構成［4］。Kusse等［5-6］首次從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Marburg中分離到了一種可以特異性降解磷壁酸的酶，將其命名為磷壁酸酶(teichoicase)。然而，有關磷壁酸酶的后續(xù)研究報道較少，在 NCBI、KEGG、BRENDA等數(shù)據(jù)庫中至今未有磷壁酸酶基因和蛋白的任何記錄。因此，本文將主要介紹磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)及命名、可能的同工酶、功能以及潛在的應用價值。

1 磷壁酸酶簡介

1.1 發(fā)現(xiàn)及命名

1972年，Wise等［7］首次以 32P標記的 Bacillus subtilis ATCC6051的磷壁酸作為底物，篩選到了具有分解磷壁酸能力的細菌，并且將其命名為磷壁酸分解(teichoic-acid eater，TAE)菌株。Wise等［7］雖然測到了TAE菌株的粗酶液具有分解磷壁酸的能力，但是他們并沒有對粗酶液中的各個組分進行分離，沒有得到純的具有分解磷壁酸能力的酶。因此，他們并不能夠確定TAE菌株的粗酶液中到底有多少種酶與磷壁酸的降解有關，也沒辦法排除是一些核酸酶的作用。隨后，1982年，Kusse等［5］以帶有14C標記的葡萄糖的磷壁酸(來自于Bacillus subtilis DSM 10)作為底物，從Bacillus subtilis Marburg的發(fā)酵液中分離并且純化到了可以特異性地降解磷壁酸的酶，并將其命名為磷壁酸酶。他們將磷壁酸酶定義為這樣一類酶:能夠特異性地作用于磷壁酸，但是不能作用于核酸類物質;具有磷酸二酯酶活性，但是不具有磷酸單酯酶活性的酶。磷壁酸酶可以作用于磷壁酸產生α-D-葡萄糖 -1，2甘油 -3-磷酸(α-D-glucose 1→2(sn)glycero-3-phosphate)。它在 Bacillus subtilis Marburg的產孢時期，活性達到最高。Kusse等［5］還測得了此 Bacillus subtilis Marburg來源的磷壁酸酶的相對分子質量，大約為310×103，由4個亞基組成，每個亞基大約為78×103。

1.2 可能的同工酶

磷壁酸酶雖在1982年已經(jīng)被提取和純化，并且測定了相對分子質量，但是，他們并沒有獲得此酶的基因和晶體結構信息。而且，此后也沒有人在相關領域發(fā)表任何有關磷壁酸酶的文章，NCBI、KEGG、BRENDA等數(shù)據(jù)庫中至今也沒有關于磷壁酸酶基因(teichoicase)和蛋白的相關信息。然而，根據(jù)磷壁酸酶作用的底物、作用特點以及產物在NCBI上進行搜索，發(fā)現(xiàn)其與甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase，GDPD)家族的一些作用底物、作用特點、產物都十分相似，尤其是 GDPD(EC:3.1.4.46)。因此，磷壁酸酶極有可能屬于GDPD家族。

GDPD家族是一類專門水解甘油磷酸二酯類底物，產生甘油-3-磷酸和相應的醇類(如:膽堿、乙醇胺、肌醇、絲氨酸)的水解酶［8-14］，催化的反應如下:

GDPD家族中一些酶的晶體結構已經(jīng)得到［11，13，15］，它們是類似于磷酸丙糖異構酶晶體結構的α/β折疊桶結構，由8個β折疊片和8個α螺旋組成。鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)是甘油磷酸二酯酶的激活劑［11，16-18］。甘油磷酸二酯酶廣泛存在于原核生物、真核生物中，并且對許多甘油磷酸二酯都具有特異性的水解能力，例如:甘油磷酸膽堿(glycerophosphocholine)、甘油磷酸乙醇胺(glycerophosphoethanolamine)、甘油磷酸甘油(glycerophosphoglycerol)、雙甘油磷酸甘油［bis(glycerophosphoglycerol)］。而這些底物在結構上與甘油型磷壁酸十分相似，都是以磷酸和甘油形成的磷酸二酯鍵作為骨架。而且，據(jù)Santos-Beneit等［19］和 Mcoughlin 等［20］的報道，甘油磷酸二酯酶在細菌對磷和碳源的利用上也發(fā)揮著重要作用。因此，甘油磷酸二酯酶極有可能是磷壁酸酶的同工酶。

2 磷壁酸酶的功能

2.1 降解細菌磷壁酸

磷壁酸酶是Kusse等［5-6］依據(jù)其可以特異性地降解磷壁酸而命名的，因此，降解磷壁酸應該就是磷壁酸酶的功能之一。根據(jù)報道，他們以Bacillus subtilis DSM 10的磷壁酸作為底物，以14C標記葡萄糖，與Bacillus subtilis Marburg來源的磷壁酸酶作用后，生成了α-D-葡萄糖-1，2甘油-3-磷酸。因此，磷壁酸酶降解磷壁酸的方式應該就是:作用于磷壁酸中的甘油-磷酸骨架，從而產生甘油-3-磷酸和甘油。

2.2 參與磷脂和磷元素代謝

根據(jù)Kusse等［5-6］的研究，磷壁酸酶作用于磷壁酸中的甘油-磷酸骨架，產生甘油-3-磷酸和甘油，而甘油-3-磷酸對于原核和真核生物都有著非常重要的作用。在原核生物中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，據(jù) Larson 等［21］報道，在 GDPD的作用下，甘油磷酸二酯類物質可以被降解，生成甘油-3-磷酸和醇類。而甘油-3-磷酸在ABC轉運蛋白的運輸下到達胞質，參與到磷脂的合成途徑中［16，22-23］，為磷脂的合成提供原料。在真核生物中，GDPD也發(fā)揮著相同的作用。Cheng等［10］報道了擬南芥在培養(yǎng)基磷饑餓的情況下，在GDPD的作用下，不僅可以從磷脂上獲得甘油-3-磷酸用以合成新的脂類，同時還可以獲得磷元素用以機體的磷代謝。另外，Santos-Beneit等［19］發(fā)現(xiàn)天藍鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)中甘油磷酸二酯酶在磷源和碳源的調節(jié)中也發(fā)揮著重要的作用。由于甘油磷酸二酯酶是磷壁酸酶可能的同工酶，而且磷壁酸酶作用于磷壁酸后的產物也為甘油-3-磷酸，因此，磷壁酸酶也極有可能在原核生物和真核生物的磷脂以及磷元素代謝過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。

2.3 阻止革蘭氏陽性致病菌對宿主細胞的黏附、定植

磷壁酸是一類由多聚甘油磷酸酯或多聚磷酸核糖醇構成的陰離子聚合物，其側鏈上羥基往往帶有丙氨酸(Ala)或者N-乙酰葡糖胺(N-acctylglucosamine，GlcNAc)，故通常帶有一定量的正電荷，形成正負電荷交替出現(xiàn)的鏈狀聚合物結構［24］。近年來，越來越多的研究表明，磷壁酸在革蘭氏陽性細菌與宿主細胞的互作中發(fā)揮著十分重要的作用［25-28］。據(jù) Weidenmaier等［29］報道，磷壁酸在金黃色葡萄球菌對大鼠鼻腔黏膜上皮細胞的黏附中發(fā)揮著重要作用。Gao等［30］利用排斥試驗和競爭試驗也證明了磷壁酸在丁酸梭菌的黏附、定植過程中發(fā)揮著主要作用。因此，磷壁酸酶對磷壁酸的降解可能導致革蘭氏陽性細菌對宿主細胞黏附率的降低，進而阻止諸如金黃色葡萄球菌等一些革蘭氏陽性細菌對宿主細胞的黏附、定植。

3 磷壁酸酶潛在的應用價值

磷壁酸酶作為一種可以特異性地降解甘油型磷壁酸的磷酸二酯酶，在細菌生理學研究和動物疾病預防方面都具有潛在的價值。

3.1 細菌生理學研究

磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)是非常重要的，它對進一步地了解革蘭氏陽性細菌磷壁酸的合成與降解以及磷脂、磷元素的代謝機制有著非常重大的意義。

在磷壁酸合成機制研究方面，黃?。?1］報道了在肺炎鏈球菌體中存在的基因spd1672是影響磷壁酸合成的關鍵基因，該基因缺失后，會導致細菌磷壁酸合成顯著減少，并且對宿主定植、侵襲能力減弱。在磷壁酸降解方面，也僅有Kusse等［5］從枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)并純化到了可以降解磷壁酸的磷壁酸酶，揭示磷壁酸酶在其他細菌和真菌中的存在狀況及其特性對于研究磷壁酸的降解機制具有重要的作用。

根據(jù)Kusse等［5-6］的研究，磷壁酸酶作用于甘油型磷壁酸后會形成α-D-葡萄糖-1，2甘油-3-磷酸。而甘油-3-磷酸往往被細菌用來合成脂類物質［16］，如磷脂。另外，據(jù) Schwan 等［23］報道螺旋原蟲(Spirochetes)在生長環(huán)境中缺乏磷源和碳源時，會降解磷脂類物質生成甘油-3-磷酸，用來當作碳源和磷源，保證細胞能夠進行正常的磷代謝以及達到較高的細胞濃度。因此，磷壁酸酶在細胞磷脂和磷代謝的過程中發(fā)揮著很大的作用。研究磷壁酸酶也將有助于更加深入地了解細胞對磷脂和磷元素的代謝過程。

3.2 動物細菌性疾病預防

根據(jù) Weidenmaier等［29］和 Gao 等［30］的報道，磷壁酸在金黃色葡萄球菌對宿主細胞的黏附、定植中發(fā)揮著重要作用。因此，磷壁酸酶可望在以下方面對預防細菌性疾病發(fā)揮作用。

3.2.1 外傷感染治療

長期以來，動物疫病多，疫情復雜始終是制約我國畜牧業(yè)健康發(fā)展的一個重要因素［32］。造成動物患病的因素是多方面的，外傷感染則是較為常見的因素之一。在造成動物外傷感染的細菌中，革蘭氏陽性細菌占有很大的比例。例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌(Streptococcus)等。這些革蘭氏陽性細菌的感染極易引起諸如肺炎、化膿性感染、敗血癥、臍帶炎等，很容易引起幼畜的死亡。目前，防治這些疾病的發(fā)生，人們主要采用注射疫苗以及飼喂抗生素類藥物的方法。但是，疫苗和抗生素類藥物的使用極易造成在動物肉類制品中殘留量超標。而且，抗生素類藥物的頻繁使用也極易使一些革蘭氏陽性致病菌產生抗性。而磷壁酸酶的使用則可以避開這些問題。磷壁酸酶用于動物外傷感染的治療主要依靠其可以降解磷壁酸，阻止革蘭氏陽性細菌對宿主細胞的定植、黏附［33］，繼而阻止其在外傷處繁殖以及產生毒素，從而達到保護動物免受外傷感染。

3.2.2 在飼料中的應用

磷壁酸酶還可以添加到動物飼料中，尤其是幼畜飼料，作為一些由革蘭氏陽性細菌造成的食入性疾病的阻斷劑。幼畜較成年動物，免疫力低，對環(huán)境的適應能力差，其機體的免疫力主要來自母體［34］。因此，向幼畜飼料中添加磷壁酸酶制劑，與溶菌酶等抑菌物質共同使用，不僅可以抑制一些致病菌的繁殖，同時也可以抑制一些革蘭氏陽性細菌磷壁酸的合成，從而達到保護幼畜的效果。磷壁酸酶制劑作為革蘭氏陽性細菌阻斷劑加入到飼料中，除了可以達到保護幼畜的效果外，還可以減少抗生素類藥物的使用，從而減少甚至避免動物肉制品中抗生素的殘留，對于無抗化養(yǎng)殖具有積極的意義。

磷壁酸酶用作飼用酶制劑，除了和其他飼用酶制劑一樣存在易變性失活的不足之外，還會在其作用特異性方面存在一些不理想的性質。由于磷壁酸酶是作為革蘭氏陽性致病菌的阻斷劑而發(fā)揮作用，它降解細胞壁中的磷壁酸從而阻止革蘭氏陽性病原菌對宿主細胞的定植、黏附［33］，達到抑制病原菌繁殖的目的，在這個過程中磷壁酸酶也可能會不加選擇地對一些有益的革蘭氏陽性細菌如雙歧桿菌等產生抑制作用，從而對動物尤其是幼畜生長產生不利影響，因此，在磷壁酸酶飼用時需要對其進行更深入的功效研究。

4 小結

磷壁酸酶自1982年由Kusse等［5］提出并命名后，至今并沒有得到其基因信息，在NCBI、KEGG、BRENDA等數(shù)據(jù)庫中也沒有關于磷壁酸酶基因和蛋白的相關信息。即便如此，我們也相信自然界肯定存在著可以特異性地降解磷壁酸的磷壁酸酶。雖然，磷壁酸酶作為酶制劑在動物飼料應用方面存在著不足，但其在動物細菌性疾病預防方面有著極大的應用潛力。而且，磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)不僅將會對細菌學研究產生重大的推動作用，對動物，尤其是幼畜動物的一些由革蘭氏陽性細菌引起的外傷感染的治療和食入性疾病的防范也有著十分重要的意義。同時，對減少動物養(yǎng)殖過程中抗生素類藥物的使用和降低動物肉制品中抗生素的殘留也有著一定的積極作用。因此，磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)，無論是在理論研究方面，還是實際應用方面，都有著非常重大的意義。

［1］ 王靜華，趙洪濤，汪以真.細菌細胞壁肽聚糖的研究進展［J］.中國獸藥雜志，2004，38(1):38-40.

［2］ 陳艷，江明鋒，葉煜輝，等.溶菌酶的研究進展［J］.生物學雜志，2009，26(2):64-66.

［3］ FLEMING A.On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions［J］.Proceedings of the Royal society of London.Series B，1922，93:306-317.

［4］ 李瑩，付艷茹，劉彥民，等.磷壁酸提取方法的研究［J］.天然產物研究與開發(fā)，2009，21(10):499-501.

［5］ KUSSER W，F(xiàn)IEDLER F.Purification，Mr-value and subunit structure of a teichoic acid hydrolase from Bacillus subtilis［J］.Febs Letters，1982，149(1):67-70.

［6］ KUSSE W，F(xiàn)IEDLER F.Teichoicase from Bacillus subtilis marburg［J］.Jouranal of Bacteriology，1983，155(1):302-310.

［7］ WISE E M，WISE J R，GLICKMAN R S，et al.Teichoic acid hydrolase activity in soil bacteria［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1972，69(1):233-237.

［8］ CORDA D，MOSCA M G，OHSHIMA N，et al.The emerging physiological roles of the glycerophosphodiesterase family［J］.The FEBS Journal，2014，281(4):998-1016.

［9］ JACKSON C J，CARR PD，LIU JW，et al.The structure and function of a novel glycerophosphodiesterase from Enterobacter aerogenes［J］.Journal of Molecular Biology，2007，367(4):1047-1062.

［10］ CHENG Y X，ZHOU W B，SHEERY N I E，et al.Characterization of the arabidopsis glycerophosphodiester phosphodiesterase(GDPD)family reveals a role of the plastid-localized AtGDPD1 in maintaining cellular phosphate homeostasis under phosphate starvation［J］.The Plant Journal，2011，66(5):781-795.

［11］ SHI L，LIU J F，AN X M，et al.Crystal structure of glycerophosphodiester phosphodiesterase(GDPD)from Thermoanaerobacter tengcongensis，a metal iondependent enzyme:insight into the catalytic mechanism［J］.Proteins:Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，2008，72(1):280-288.

［12］ DENLOYE T，DALAL S，KLEMBA M.Characterization of a glycerophosphodiesterase with an unusual tripartite distribution and an important role in the asexual blood stages of Plasmodium falaciparum［J］.Molecular＆ Biochemical Parasitology，2012，186(1):29-37.

［13］ RAO K N，BONANNO J B，BURLEY S K，et al.Crystal structure of glycerophosphodiester phosphodiesterase from Agrobacterium tumefaciens by SAD with a large Asymmetric Unit［J］.Proteins:Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，2006，65(2):514-518.

［14］ VAN DER REST B，ROLLAND N，BOISSON A M，et al.Identification and characterization of plant glycerophosphodiester phosphodiesterase［J］.Biochemical Journal，2004，379(3):601-607.

［15］ SANTELLI E，SCHWARZENBACHER R，MCMULLAN D，et al.Crystal structure of a glycerophosphodiester phosphodiesterase(GDPD)from Thermotoga maritima(TM1621)at 1.60 ? resolution［J］.Proteins:Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，2004，56(1):167-170.

［16］ LARSON T J，EHRMANN M，BOOS W.Periplasmic glycerophosphodiester phosphodiesterase of Escherichia coli，a new enzyme of the glp regulon［J］.The Journal of Biological Chemistry，1983，258(9):5428-5432.

［17］ LARSON T J，VAN LOO-BHATTACHARYA A T.Purification and characterization of glpQ-encoded glycerophosphodiester phosphodiesterase from Escherichia coli k-12［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1988，260(2):577-584.

［18］ OHSHIMA N，YAMASHITA S，TAKAHASHI N，et al.Escherichia coli cytosolic glycerophosphodiester phosphodiesterase(UgpQ)requires Mg2+，Co2+，or Mn2+for its enzyme activity［J］.Journal of Bacteriology，2008，190(4):1219-1223.

［19］ SANTOS-BENEIT F，RODRíGUEZ-GARCíA A，APEL A K，et al.Phosphate and carbon source regulation of two PhoP-dependent glycerophosphodiester phosphodiesterase genes of Streptomyces coelicolor［J］.Microbiology，2009，155(6):1800-1811.

［20］ MCLOUGHLIN S Y，JACKSON C，LIU J W，et al.Growth of Escherichia coli coexpressing phosphotriesterase and glycerophosphodiester phosphodiesterase，using Paraoxon as the sole phosphorus source［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70(1):404-412.

［21］ SCHMIDL S R，OTTO A，LLUCH-SENAR M，et al.A trigger enzyme in Mycoplasma pneumoniae:impact of the glycerophosphodiesterase GlpQ on virulence and gene expression［J］.PLoS Pathogens，2011，7(9):e1002263.

［22］ LIN E E C.Glycerol dissimilation and its regulation in bacteria［J］.Annual Review of Microbiology，1976，30:535-578.

［23］ SCHWAN T G，BATTISTI J M，PORCELLA S F，et al.Glycerol-3-phosphate acquisition in Spirochetes:distribution and biological activity of glycerophosphodiester phosphodiesterase(GlpQ)among Borrelia species［J］.Journal of Bacteriology，2003，185(4):1346-1356.

［24］ LOVERING A L，LIN L Y C，SEWELL E W，et a1.Structure of the bacterial teichoic acid polymerase TagF provides insights into membrane association and catalysis［J］.Nature Structural ＆ Molecular Biology，2010，17(5):582-589.

［25］ XIA G Q，KOHLER T，PESCHEL A.The wall teichoic acid and lipoteichoic acid polymers of Staphylococcus aureus［J］.International Journal of Medical Microbiology，2010，300(2/3):148-154.

［26］ WEIDENMAIER C，PESCHEL A.Teichoic acids and related cell-wall glycopolymers in Gram-positive physiology and host interactions［J］.Nature Reviews Microbiology，2008，6(4):276-287.

［27］ OKU Y，KUROKAWA K，MATSUO M，et al.Pleiotropic roles of polyglycerolphosphate synthase of lipoteichoic acid in growth of Staphylococcus aureus cells［J］.Journal of Bacteriology，2009，191(1):141-151.

［28］ COT M，RAY A，GILLERON M，et al.Lipoteichoic acid in Streptomyces hygroscopicus:structural model and immunomodulatory activities［J］.PLoS One，2011，6(10):e26316.

［29］ WEIDENMAIER C，KOKAI-KUN J F，KRISTIAN S A，et al.Role of teichoic acids in Staphylococcus aureus nasal colonization，a major risk factor in nosocomial infections［J］.Nature Medicine，2004，10(3):243-245.

［30］ GAO Q X，WU T X，WANG J B，et al.Inhibition of bacterial adhesion to HT-29 cells by lipoteichoic acid extracted from Clostridium butyricum［J］.African Journal of Biotechnology，2011，10(39):7633-7639.

［31］ 黃健.一種肺炎鏈球菌體磷壁酸合成相關蛋白SPD1672功能研究［D］.碩士學位論文.重慶:重慶醫(yī)科大學，2011:5.

［32］ 于維軍.我國動物疫病發(fā)生現(xiàn)狀及防治中存在的問題［J］.動物科學與動物醫(yī)學，2003，20(7):1-3.

［33］ 王進波，倪江，高權新，等.磷壁酸在細菌黏附、定植及免疫調節(jié)過程中的作用［J］.動物營養(yǎng)學報，2013，25(9):1916-1920.

［34］ BERGER-B?CHIA B.Resistance mechanisms of gram-positive bacteria［J］.International Journal of Medical Microbiology，2002，292(1):27-35.