許 晶 齊寶坤 趙青山 金 花 張曉松 江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院1，哈爾濱 150030）（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性的關(guān)系

許 晶1齊寶坤2趙青山1金 花1張曉松1江連洲2

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院1，哈爾濱 150030）（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，哈爾濱 150030）

對(duì)不同品種大豆分離蛋白溶解性、表面疏水性、巰基含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)采用拉曼光譜法對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行分析，探討大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系。結(jié)果表明：不同品種大豆分離蛋白表面疏水性由大到小順序依次為：東農(nóng)46（743.87）＞皖豆24（730.14）＞黑農(nóng)46（717.54）＞五星4（625.22）＞中黃13（613.38）＞冀NF58（600.61），并與溶解性呈負(fù)相關(guān)，與巰基含量呈正相關(guān)。不同品種大豆分離蛋白具有不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)α－螺旋含量降低、無(wú)規(guī)卷曲含量升高時(shí)，蛋白分子結(jié)構(gòu)變的松散，使包埋在分子內(nèi)部的疏水性殘基更多的暴露出來(lái)，導(dǎo)致表面疏水性增加。

大豆分離蛋白 結(jié)構(gòu)特性 表面疏水性

大豆分離蛋白（SPI）是一種重要的植物蛋白產(chǎn)品，不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，還具有如溶解性、凝膠性、乳化性、起泡性和表面性質(zhì)等功能特性。蛋白質(zhì)的疏水作用是一種配位體間非共價(jià)鍵相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，構(gòu)想和蛋白質(zhì)功能具有重大意義。蛋白質(zhì)的疏水性可被分為2類：1）表面疏水性，與疏水基在蛋白質(zhì)表面暴露的程度有關(guān)；2）蛋白質(zhì)氨基酸殘基的平均疏水性，取決于氨基酸殘基從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)物相的自由能［1］。蛋白質(zhì)的表面疏水性不僅與加工條件、加工方法有關(guān)，而且與蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性等密切相關(guān)［2］，并且隨著大豆品種和產(chǎn)地的不同而有所差異。

拉曼光譜是一種與分子或晶格振動(dòng)相關(guān)的光子非彈性散射光譜。利用物質(zhì)的拉曼光譜特異性，以散射光的強(qiáng)度隨拉曼位移的變化表示，通過(guò)峰的位置和強(qiáng)度，反映功能團(tuán)或化學(xué)鍵的特征振動(dòng)頻率及分子結(jié)構(gòu)［3］。拉曼光譜可以用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、巰基和二硫鍵以及氨基酸側(cè)鏈等結(jié)構(gòu)的分析。

本試驗(yàn)對(duì)不同品種大豆分離蛋白溶解性、表面疏水性、巰基含量進(jìn)行測(cè)定，并采用拉曼光譜法對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行分析，進(jìn)而探討大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系，為改善大豆分離蛋白的功能性質(zhì)和拓展其應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)，以期為大豆精深加工及高值化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆品種：東農(nóng)46；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；皖豆24：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所；黑農(nóng)46：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所；中黃13：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所；冀NF58、五星4：河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所。

SDS、Tris、甘氨酸、5，5′－二硫雙 －2－硝基苯甲酸（DTNB）、8－苯胺基 －1－萘磺酸（ANS）：美國(guó)Sigma公司；蛋白 Marker（SM0431）：Fermentas life sciences公司。

PerkinElmer Raman Station 400拉曼光譜儀：美國(guó)PE公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備

原料大豆經(jīng)去皮、粉碎后過(guò)60目篩，然后在40℃條件下采用正己烷萃取以制備脫脂豆粕。將脫脂豆粕按1∶15的質(zhì)量比與水混合，用2 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0，攪拌l.5 h后，將其懸浮液在4℃條件下7 500 r/min離心 30 min，取上清液用 2 mol/L HCl調(diào)pH至4.5。靜置后在4℃條件下4 500 r/min離心30 min，取蛋白沉淀水洗2次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH調(diào) pH至7.0。再在4℃條件下7 500 r/min離心30 min，除去少量的不溶物，將其蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀大豆分離蛋白。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2010）。

1.2.2 蛋白質(zhì)溶解性的測(cè)定

蛋白質(zhì)溶解性的測(cè)定參考Samoto等［4］的方法。稱取100 mg蛋白樣品分散于10 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min，20℃、9 000 r/min離心20min。上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度以上清液中蛋白含量占總蛋白含量的質(zhì)量濃度（mg/g）來(lái)表示。

1.2.3 蛋白質(zhì)表面疏水性的測(cè)定

根據(jù)Kato等［5］采用的ANS熒光探針?lè)▽?duì)蛋白質(zhì)表面疏水性進(jìn)行測(cè)定。分別稱取0.025 g不同品種蛋白樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）中，在室溫條件下攪拌1.0 h，然后在7 500 r/min離心30 min，取上清液用Lowry法測(cè)定蛋白濃度，并用同一磷酸鹽緩沖液依次稀釋（濃度在0.005～0.5 mol/mL之間）后，取不同濃度樣品的溶液4 mL，分別加入40μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液（用0.01 mol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制），經(jīng)振蕩后靜置3 min，再測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（FI）。試驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng)λex＝370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem＝490 nm，夾縫為5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性（H0）。

1.2.4 蛋白質(zhì)巰基含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)巰基含量的測(cè)定參考Shimada等［6］改進(jìn)的Ellman試劑法，并做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

游離巰基的測(cè)定：取2 mL大豆分離蛋白溶液，加入5 mL Tris－甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris－0.09 mol/L甘氨酸 －4 mmol/L Na2EDTA，pH 8.0）中，再加入4 mg/mL DTNB的Ellman試劑0.1 mL，測(cè)定時(shí)溶液經(jīng)漩渦迅速混合后在25℃下保溫反應(yīng)15 min，用分光光度計(jì)測(cè)定其在412 nm處吸光度值（A412），以不加Ellman試劑的溶液作為對(duì)照，每組樣品測(cè)定3次取平均值。

總巰基的測(cè)定：取2 mL大豆分離蛋白溶液，加入5 mL Tris－甘氨酸－8MUrea－0.5%SDS溶液中，再加入4 mg/mL DTNB的Ellman試劑0.1 mL，測(cè)定時(shí)溶液經(jīng)漩渦迅速混合后在25℃下保溫反應(yīng)15 min，用分光光度計(jì)測(cè)定其在412 nm處吸光度值（A412），以不加Ellman試劑的溶液作為對(duì)照，每組樣品測(cè)定3次取平均值。

巰基含量計(jì)算公式如下：

式中：A412為加Ellman試劑時(shí)樣品的吸光度與不加Ellman試劑時(shí)樣品的吸光度的差值；D為樣品稀釋系數(shù)；C為樣品的蛋白質(zhì)最終濃度/mg/mL。

1.2.5 拉曼光譜測(cè)定

參考張萍等［7］方法。將大豆分離蛋白分散于相應(yīng)的pH緩沖液中配制成100 mg/mL樣品溶液進(jìn)行拉曼光譜測(cè)定，激發(fā)光波長(zhǎng)為785 nm，發(fā)射功率為300 mW，拉曼光譜掃描范圍為400～2 000 cm－1，每個(gè)樣品都重復(fù)掃描3次，各樣品的拉曼譜圖都由計(jì)算機(jī)作信號(hào)累加平均并繪圖輸出，峰位誤差小于±3 cm－1。以苯丙氨酸的 1 003 cm－1作為歸一化因子，以此作為各拉曼峰強(qiáng)度變化的依據(jù)，得到大豆分離蛋白的拉曼光譜圖。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸側(cè)鏈數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)軟件擬合輸出，用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)x±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS V17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異，采用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量測(cè)定

不同品種大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，見表1。由表1可知，不同品種大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量較接近，且均大于90%，純度較高，達(dá)到了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 不同品種大豆分離蛋白的蛋白質(zhì)含量

2.2 不同品種大豆分離蛋白的溶解性和表面疏水性分析

不同品種大豆分離蛋白的溶解性和表面疏水性見表2。由表2可以看出，不同大豆分離蛋白種類對(duì)溶解性和表面疏水性有一定的影響。對(duì)于溶解性來(lái)說(shuō)，由大到小順序依次為：冀NF58＞中黃13＞五星4＞皖豆24＞黑農(nóng)46＞東農(nóng)46；而表面疏水性與溶解性大致相反，由大到小順序依次為：東農(nóng)46＞皖豆24＞黑農(nóng)46＞五星4＞中黃13＞冀NF58。這表明表面疏水性與溶解性呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與Paraman等［8］研究的大米蛋白表面疏水性與溶解性呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相一致。分析原因可能是由于蛋白質(zhì)表面疏水性主要取決于暴露于蛋白質(zhì)分子表面的疏水性殘基，當(dāng)疏水性殘基暴露在分子表面時(shí)，則表現(xiàn)為一定的疏水性，而暴露在蛋白分子表面的疏水性殘基廣泛的參與分子間作用，使得蛋白質(zhì)的溶解性降低；此外，溶解性較好的蛋白質(zhì)表面存在著較少的疏水性殘基［9］，這也有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有較好溶解性的同時(shí)，其表面疏水性較差。

表2 不同品種大豆分離蛋白的溶解性和表面疏水性

2.3 不同品種大豆分離蛋白的巰基含量分析

不同品種大豆分離蛋白的游離巰基含量、總巰基含量及游離巰基與總巰基的比值見圖1。如圖1所示，6種大豆分離蛋白的游離巰基含量、總巰基含量及游離巰基與總巰基的比值與其相應(yīng)表面疏水性數(shù)值（表2）的變化規(guī)律相似，由大到小順序依次為：東農(nóng)46＞皖豆24＞黑農(nóng)46＞五星4＞中黃13＞冀NF58，說(shuō)明具有較高的游離巰基含量、總巰基含量及游離巰基與總巰基比值的大豆分離蛋白品種同時(shí)具有較高的表面疏水性。游離巰基與總巰基的比值反應(yīng)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的解折疊程度，游離巰基與總巰基的比值越大，大豆分離蛋白的解折疊程度越強(qiáng)，分子結(jié)構(gòu)越趨于暴露式，疏水性殘基的暴露使得表面疏水性增強(qiáng)［10］，這表明品種差異對(duì)大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)影響較大，同時(shí)這種結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)引起表面疏水性的改變。Gu等［11］研究表明表面疏水性與游離巰基含量呈線性正相關(guān)，蛋白質(zhì)的解折疊和疏水性殘基的暴露是表面疏水性增大的原因；Krause等［12］認(rèn)為改性蛋白表面疏水性的增加也是由于蛋白質(zhì)的解折疊和疏水性殘基的暴露引起的，這些研究均與本研究結(jié)果相一致。

圖1 不同品種大豆分離蛋白的巰基含量

2.4 不同品種大豆分離蛋白的拉曼光譜分析

采用拉曼光譜對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過(guò)拉曼光譜吸收峰位置和強(qiáng)度的變化，可以得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息以及氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象信息的變化情況［13］。圖2為6種大豆分離蛋白的拉曼光譜圖，在對(duì)拉曼光譜進(jìn)行分析中，大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)變化的定量信息，可以根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)所指認(rèn)吸收峰的相對(duì)強(qiáng)度來(lái)表示，采用特定軟件可對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量和氨基酸側(cè)鏈信息進(jìn)行擬合分析。

圖2 不同品種大豆分離蛋白的拉曼光譜圖

2.4.1 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由酰胺Ⅰ帶（AmideⅠbands）和酰胺Ⅲ帶（AmideⅢ bands）的拉曼特征峰確定。酰胺Ⅰ帶拉曼特征峰位置為：α－螺旋為1 645～1 660 cm－1，β－折疊為 1 665～1 680 cm－1，β－轉(zhuǎn)角為1 680～1 690 cm－1，無(wú)規(guī)卷曲為1 660～1 670 cm－1。酰胺Ⅲ帶拉曼特征峰位置為：α－螺旋為1 265～1 300 cm－1，β－折疊為 1 230～1 240 cm－1，β－轉(zhuǎn)角為 1305 cm－1，無(wú)規(guī)卷曲為 1 240～1 260 cm－1［14］。本研究中采用 Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件對(duì)大豆分離蛋白的拉曼圖譜二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅲ帶擬合不同品種大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)/%

結(jié)合表面疏水性（表2）的分析，由表3可以看出，在酰胺I帶處，α－螺旋含量越小，無(wú)規(guī)卷曲含量越大，表面疏水性越高。線性相關(guān)性分析表明，表面疏水性與α－螺旋含量呈顯著的負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為－0.936），與無(wú)規(guī)卷曲含量呈顯著的正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.991），與β－折疊含量和β－轉(zhuǎn)角含量之間不存在顯著的線性關(guān)系。這與酰胺Ⅲ帶得到的結(jié)果相似，雖然酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶擬合得出的大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量在數(shù)值上存在一定差異，但與表面疏水性的相關(guān)性上相一致。綜合酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶擬合的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可知，不同品種大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定差異，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α－螺旋含量降低，無(wú)規(guī)卷曲含量升高，即二級(jí)結(jié)構(gòu)由α－螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變時(shí)，使分子結(jié)構(gòu)變的松散，包埋在分子內(nèi)部的疏水性殘基更多的暴露出來(lái)，導(dǎo)致表面疏水性的增加［15］。本研究結(jié)果與王辰等［16］采用紅外光譜法研究大豆分離蛋白表面疏水性與α－螺旋含量呈負(fù)相關(guān)且與無(wú)規(guī)卷曲含量呈正相關(guān)的結(jié)果相一致。

2.4.2 蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的分析

由酪氨酸的苯環(huán)呼吸振動(dòng)和苯環(huán)平面外彎曲振動(dòng)倍頻之間的費(fèi)米共振引起850 cm－1和830 cm－1左右的特征峰隨側(cè)鏈微環(huán)境而變，利用這2條譜線的強(qiáng)度比可以分析蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基的暴露與埋藏［17］。當(dāng) I850/I830的比值為 1.25～1.40時(shí)，表明酪氨酸殘基完全暴露于分子表面；當(dāng)I850/I830的比值為0.3～0.5時(shí)，酪氨酸殘基完全埋藏于分子內(nèi)部；當(dāng)比值為0.7時(shí)，酪氨酸殘基為電離狀態(tài)。根據(jù)I850/I830還可以進(jìn)一步計(jì)算出暴露于分子表面和包埋在分子內(nèi)部的酪氨酸殘基的分子數(shù)N［18］。

由表4可以看出，6種大豆分離蛋白I850/I830的比值更接近1.25～1.40，說(shuō)明酪氨酸殘基趨向于“暴露式”。結(jié)合酪氨酸殘基暴露與包埋分子數(shù)可以看出，不同品種大豆分離蛋白酪氨酸殘基暴露分子數(shù)（N暴：N包）的大小順序?yàn)椋簴|農(nóng)46＞皖豆24＞黑農(nóng)46＞五星4＞中黃13＞冀NF58，而這與表面疏水性（表2）的變化趨勢(shì)相一致，這表明不同品種大豆分離蛋白酪氨酸殘基的暴露程度不同，蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基較多暴露于分子表面會(huì)使蛋白質(zhì)的表面疏水性升高。

表4 不同品種大豆分離蛋白酪氨酸費(fèi)米共振線I850/I830以及殘基暴露/包埋分子數(shù)

756 cm－1處的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側(cè)鏈，不同品種大豆分離蛋白756 cm－1處的拉曼強(qiáng)度分別為0.964（東農(nóng)46）、0.941（皖豆 24）、0.930（黑農(nóng) 46）、0.895（五星 4）、0.889（中黃 13）、0.834（冀 NF58），大小順序依次為：東農(nóng)46＞皖豆24＞黑農(nóng)46＞五星4＞中黃13＞冀NF58。大豆分離蛋白的色氨酸譜帶的強(qiáng)度越大，表明色氨酸殘基由埋藏在蛋白分子內(nèi)部向蛋白分子的表面暴露。結(jié)合表面疏水性（表2）分析可知，不同品種大豆分離蛋白色氨酸殘基的暴露程度不同，較多的色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面會(huì)引起表面疏水性的增加。

埋藏在非極性側(cè)鏈氨基酸殘基暴露到蛋白質(zhì)分子表面，很可能是導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增加的一個(gè)重要原因。

3 結(jié)論

不同品種大豆分離蛋白表面疏水性由大到小順序依次為：東農(nóng)46（743.87）＞皖豆24（730.14）＞黑農(nóng)46（717.54）＞五星 4（625.22）＞中黃 13（613.38）＞冀 NF58（600.61），并與溶解性呈負(fù)相關(guān)，與巰基含量呈正相關(guān)。不同品種大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定差異，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α－螺旋含量降低、無(wú)規(guī)卷曲含量升高時(shí)，蛋白表面疏水性的增加。

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Relationship Between Structural Properties and Surface Hydrophobicity of Soybean Protein Isolate

Xu Jing1Qi Baokun2Zhao Qingshan1Jin Hua1Zhang Xiaosong1Jiang Lianzhou2
（College of Science，Northeast Agricultural University1，Haerbin 150030）（College of Food Science，Northeast Agricultural University2，Haerbin 150030）

The solubility，surface hydrophobicity and sulfhydryl content of different varieties of soybean protein isolate weremeasured.The secondary structure and amino acid side chains of protein were analyzed by Raman spectrum method at the same time.Relationship between structural properties and surface hydrophobicity of soybean protein isolate was discussed.The results showed that the order for surface hydrophobicity of different varieties of soybean protein isolate from big to smallwas Dongnong 46（743.87）＞W(wǎng)andou 24（730.14）＞Heinong 46

（717.54）＞W(wǎng)uxing 4（625.22）＞Zhonghuang 13（613.38）＞JiNF 58（600.61），which was negatively correlated with solubility and positively correlated with sulfhydryl content.Different varieties of soybean protein isolate had different secondary structures.When alpha helix contentwas lower and random coil content increased，molecular structure of protein became loose.The hydrophobic residues embeddingwithin themoleculeweremore exposed，which led to the increase of surface hydrophobicity.

soybean protein isolate，structure properties，surface hydrophobicity

TS201

A

1003－0174（2015）08－0032－06

時(shí)間：2015－05－05 07：38

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20150505.0738.009.html

中國(guó)博士后特別資助（2014T70306），國(guó)家自然科學(xué)基金（31301600），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金（2012 RCB17）

2014－10－09

許晶，女，1979年出生，博士，植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白工程