高美玲 蔡強 柯昌斌? 許先成 王賢裕

帕瑞昔布鈉抑制補體C3表達減輕骨癌痛的實驗分析

高美玲 蔡強 柯昌斌? 許先成 王賢裕

目的 探討帕瑞昔布鈉抑制補體C3表達減輕骨癌痛的作用。方法 健康雌性SD大鼠120只，體重160～200 g，隨機分為4組（每組30只）：假手術(shù)組（S組）、骨癌痛組（P組）、帕瑞昔布鈉治療組（T組）和C3補體抑制劑（PEG-Cp40）干預組（C組）。P組、T組和C組均采用脛骨髓腔內(nèi)注射Walker-256乳腺癌細胞的方法建立大鼠脛骨癌痛模型，S組脛骨骨髓腔內(nèi)注射等量生理鹽水。T組和C組分別鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉和PEG-Cp40蛋白質(zhì)10mg。分別于造模前1d及術(shù)后3、5、7、14d時測定機械痛閾值，痛閾測定結(jié)束后處死大鼠，取脊髓組織，采用免疫比濁法測定脊髓后角中C3補體的表達情況；采用RT-PCR法測定C3的mRNA表達情況。結(jié)果 與S組比較，P組接種后5～14d機械痛閾下降（P＜0.05），C3含量和mRNA水平明顯上調(diào)（P＜0.05）；與P組比較，T、C組造模后7～14d機械痛閾升高（P＜0.05），C3含量和mRNA水平明顯下降（P＜0.05）；T、C組間未見明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 帕瑞昔布鈉可能通過抑制C3作用來減輕骨癌痛。

帕瑞昔布鈉 補體C3 小膠質(zhì)細胞 骨癌痛

骨癌性痛是一種劇烈的、頑固性的疼痛，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，但發(fā)病機制尚未完全明確［1］。在骨癌痛的既往研究中［2］發(fā)現(xiàn)有補體系統(tǒng)參與的現(xiàn)象，補體系統(tǒng)是具有精密調(diào)控機制的蛋白質(zhì)反應系統(tǒng)，其中C3的激活被認為與疼痛有重要關(guān)系［3］。帕瑞昔布鈉是一種新型的特異性環(huán)氧化酶 （COX-2）抑制劑，通過抑制外周和中樞COX-2表達，來減少外周和中樞前列腺素的合成，抑制痛覺超敏，提高痛閾，臨床上主要用于與創(chuàng)傷和癌痛有關(guān)的治療。但帕瑞昔布鈉用于癌性痛治療時對C3的影響尚不清楚，本實驗擬建立標準的大鼠脛骨癌痛模型，推測帕瑞昔布鈉可能通過激活補體系統(tǒng)，特別是C3而促進骨癌痛的形成與維持。

1 臨床資料

1.1 一般資料 健康成年雌性SD大鼠120只，體重150～200g，實驗室室溫22℃～24℃，濕度40%～60%，采用12h晝夜周期光照，自由進食、飲水。隨機分為4組（每組30只）：假手術(shù)組（S組）、骨癌痛組（P組）、帕瑞昔布鈉治療組（T組）和C3補體抑制劑（PEG-Cp40）干預組（C組）。帕瑞昔布鈉由Pharmacia and Upjohn公司合成，C3補體抑制劑（PEG-Cp40）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法 大鼠脛骨癌痛模型制備：將凍存于液氮中的Walker-256乳腺癌細胞復蘇后，種植于傳代用雌性SD大鼠腹腔，飼養(yǎng)7d左右出現(xiàn)大量腹水，局部消毒后從腹腔抽取含腫瘤細胞的腹水20 ml；經(jīng)離心沉淀后，稀釋至所需濃度（約1×108個細胞/ml），保存于冰箱備用。腹腔注射氯胺酮50mg/kg麻醉，P、T、C各組大鼠于左脛骨上段切開軟組織約5mm小口，暴露脛骨，采用5ml注射器針頭于骨上穿刺鉆孔，再用微量注射器緩慢注入腫瘤細胞懸浮液5μl（1×104個），骨蠟封堵針孔，沖洗并縫合皮膚，創(chuàng)口處涂青霉素鈉粉末預防感染，S組脛骨髓腔內(nèi)注射等量生理鹽水，余處理同上。于造模即刻起，T組鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉10mg；C組鞘內(nèi)注射PEG-Cp40蛋白10mg。

1.3 測定方法 行為學的測定：四組小鼠分別于術(shù)后1、3、5、7、14d，采用機械刺激儀測痛閾值。傷肢機械痛閾值按照Dixon 介紹的方法測定。補體C3水平測定：處死大鼠，取其脊髓標本，稱重后，按 1：9加入冰鹽水，制成10%脊髓勻漿，4℃下離心，取100μl上清液加入1ml抗血清，再次旋渦混合器混勻30s，置于 37 ℃ 恒溫水槽水浴15min，將紫外分光光度儀波長設(shè)置為340nm，以生理鹽水為調(diào)零點，測定各管吸光度（A值）。根據(jù)試劑盒中已給出的各標準品的濃度值以及本次試驗測定A值，繪制出一條標準曲線，隨即得出一個線形方程式 ： Y=aX+b，Y：A值，X：不同稀釋比例標準品的C3濃度值，a、b為系數(shù)，根據(jù)該公式可以求得各個標本的C3濃度值。采用兩步法RT-PCR檢測脊髓組織補體C3 mRNA的表達：引物合成：上游引物5'-GCTGTGCCTTATGTCATTGTCC-3'下游引物5'-ATTTCTCCCACTGT TCGGTCTG-3'。以β-actin 作為內(nèi)參。組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：取脊髓組織20～40mg，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA?；驍U增：反應條件為94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30個循環(huán)；72℃，10min。1/4電泳及凝膠成像，采用Quantity One 4.0軟件分析結(jié)果。1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)后不同時點機械痛閾的比較 見表1。

表1 四組大鼠術(shù)后不同時點機械痛閾的比較（x±s）

2.2 大鼠術(shù)后脊髓C3含量和mRNA表達水平的比較 見表2。

表2 四組大鼠術(shù)后脊髓C3含量和mRNA表達水平的比較（x±s）

3 討論

本實驗建立的大鼠脛骨癌痛模型操作簡單、測痛技術(shù)成熟，與人類骨癌痛病理生理學特征相似，被廣泛應用于骨癌性痛的實驗研究［4］。補體系統(tǒng)是具有精密調(diào)控機制的蛋白質(zhì)反應系統(tǒng)，是非特異性免疫的重要組成部分之一。有經(jīng)典途徑、凝集素途徑和旁路途徑三種激活途徑，雖然啟動途徑不同，但最終都匯集于一點，即C3轉(zhuǎn)化酶對C3的分解，最后進入共同的終端通路。可見C3在補體系統(tǒng)已知的三條激活途徑中處于樞紐地位，是補體系統(tǒng)激活的必要條件。補體系統(tǒng)是非特異性免疫的重要組成部分之一，其廣泛參與機體免疫和炎癥反應，而且與疼痛的發(fā)生密切相關(guān)［5～7］。

本資料結(jié)果表明，與S組比較，P組術(shù)后各測量時點機械痛閾降低，并出現(xiàn)漸行性加重的自發(fā)痛行為，提示該模型制備成功。在術(shù)后第5天，P組痛閾明顯下降，可能通過激活神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞和星狀細胞，引起補體水平激增有關(guān)［7］。與S組比較，P組C3水平上調(diào)明顯，提示補體C3可能參與了大鼠脛骨癌痛的發(fā)生與發(fā)展。C組鞘內(nèi)注射CP40后，C3含量和C3在脊髓中的mRNA表達水平明顯下調(diào)，抑制大鼠疼痛的程度亦明顯增強，表明C3的表達水平與疼痛具有同步性。而T組鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉后，C3含量和C3在脊髓中的mRNA表達水平亦明顯下調(diào)，與C組比較無明顯差異，表明帕瑞昔布鈉包含有CP40相同的作用機制，帕瑞昔布鈉可能通過減弱疼痛傳入神經(jīng)對中樞系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞和星狀細胞的活化作用，進而抑制補體C3等水平的攀升，減少了膜攻擊復合物MAC的形成和炎癥介質(zhì)白細胞介素-1、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α的激活［8］，減少神經(jīng)元細胞的活化，達到阻止和逆轉(zhuǎn)疼痛的作用，但補體活化在骨癌痛中如何發(fā)揮作用，還需后續(xù)試驗證實。

1 Jie Xu, Ming DiZhu, Yong JingGao,et al． NFκB-mediated CXCL1 production in spinal cord astrocytes contributes to the maintenance of bone cancer pain in mice． J Neuroinflammation,2014,11(1):38．

2 Nie F, Wang J, Su D, et al． Abnormal activation of complement C3 in the spinal dorsal horn is closely associated with progression of neuropathic pain．Int J Mol Med,2013, 31(6):1333～1342．

3 徐濤,魏安寧,黃良庫,等．補體C3對神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓星形膠質(zhì)細胞的影響．中國疼痛醫(yī)學雜志,2012,18(3):169～173．

4 Wacnik PW, kehl LJ, Trempe TM, et al． Tumor implantation in mouse humerus evokes movement-related hyperalgesia exceeding that evoked by intramuscular carrageenan． Pain, 2003, 101(3):175～186．

5 Levin ME,Jin JG,Ji RR,et al．Complement activation in the peripheral nervous system following the spinal nerve ligation model of neuropathic pain． Pain, 2008, 137(1):182～201．

6 Twining CM,Sloane EM,Schoeniger DK,et al．Activation of the spinal cord complement cascade might contribute to mechanical allodynia induced by three animal models of spinal sensitization． J Pain,2005,6(3):174～183．

7 王金保,聶發(fā)傳,顧建騰,等．大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型血清和腦脊液補體C3的動態(tài)變化．臨床麻醉學雜志,2008,11(24):967～969．

8 Hains BC, Waxman SG． Activated microglia contribute to the maintenance of chronic pain after spinal cord injury． Neurosci, 2006, 26(2): 4308～4317．

Objective To evaluate the role of Dynastat Reduce bone cancer pain by inhibiting C3 expression. Methods One hundred and twenty famale SD rats weighing 160-200g were randomly divided into four groups:(n=30)：sham operation group (group S)，BCP group，Dynastat therapy group (group T)and C3 inhibitors group (group C) Tibia bone cancer pain was induced by intra-tibial inoculation of Walker-256 breast cancer cells in groups P，T and C ，group S was injected with normal saline. Dynastat and C3 inhibitors were injected intrathecally in groups N and C respectively. Mechanical pain threshold Was measured at 1 day before and at 3，5,7 and 14 days after BCP．Using immunoturbidimetry and PCR technique to measure C3 content and expression level of mRNA respectively. Results Compared with groups S,mechanical pain threshold was significantly decreased from 5-14 d after inoculation in group p（P＜0.05）,the content of C3 and mRNA level significantly was raised （P＜0.05）; Compared with groups P, mechanical pain threshold was significantly decreased from 5-14 d after inoculation in group T and C. The content of C3 and mRNA level were significantly declined（P＜0.05）.There was no significant statistical difference between group T and C. Conclusion Dynastat may inhibit the bone cancer pain through its inhibiting effect of C3.

Parry sodium Complement C3 Microglia cells Bone cancer pain

442000 湖北省十堰市太和醫(yī)院麻醉科（高美玲 柯昌斌許先成 王賢裕）

442000 湖北省十堰市東風公司總醫(yī)院麻醉科（蔡強）

*通訊作者