武華玉　程碧軍　喬木　黃京書　劉貴生　彭先文　李良華　吳俊靜　梅書棋

摘要：克隆了MBF1基因875 bp的cDNA序列和1 919 bp的基因全序列（登錄號：EF 625885）。序列分析表明，豬MBF1基因序列與人、小鼠的相似性分別為89%和88%，氨基酸序列與人和小鼠的相似性分別為99%和97%，豬MBF1基因包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，內(nèi)含子的剪接方式都符合“GT-AG”法則；組織表達(dá)譜分析表明MBF1基因在心、肝、脾、腎、子宮中表達(dá)量較高，在胃和小腸中低表達(dá)。

關(guān)鍵詞：豬；MBF1基因；克隆；序列分析

中圖分類號：Q78 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5748-03

Abstract： In this study， 875 bp mRNA sequence and 1 919 bp genomic sequence （EF 625885）of porcine MBF1 gene （multiprotein bridging factor 1） were cloned. A multiple alignment of MBF1 sequences showed that porcine MBF1 sequence had 89% identity with that of human， 88% identity with that of mouse， Amino acid sequence analysis showed that MBF1 had 99% identity with that of human， 97% identity with that of mouse. Sequence analysis revealed that porcine MBF1 gene consists of 5 exons and 4 introns and the locations of splice donor/acceptor sites in all introns conform to “GT/AG” rule. RT-PCR analysis showed that MBF1 gene was highly expressed in heart， liver， spleen， kidney， uterus， and lowly expressed in stomach and small intestine.

Key words： porcine； MBF1 gene； clone； sequence analysis

多蛋白橋梁因子（Multiprotein bridging factor 1， MBF1）是一種核受體輔激活因子，其通過橋連通用轉(zhuǎn)錄因子TBP和基因特異性轉(zhuǎn)錄因子，增強特異性轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性和結(jié)合靶基因的啟動子活性，介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)生物體的各種生命活動[1-3]。MBF1是一個高度保守的調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、脂類和組氨酸新陳代謝的轉(zhuǎn)錄輔激活蛋白[4，5]。人類MBF1結(jié)合TBP在類固醇激素生成中起重要調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)類固醇激素的生成[6]。MBF1還可以增強一些與脂類代謝相關(guān)的核受體轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)核受體的活性以調(diào)節(jié)脂質(zhì)的動態(tài)平衡[4]。本研究克隆了豬MBF1基因，研究其表達(dá)模式，為進一步研究MBF1對豬生長發(fā)育調(diào)控的分子遺傳機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集4月齡大白豬（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場）、梅山豬（英山縣綠源養(yǎng)豬專業(yè)合作社）的肌肉組織，液氮速凍后置于-70 ℃冰箱中，利用Trizol提取總RNA，利用DNA提取試劑盒提取DNA，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及引物

pMD-18T vector system、DH5α購自寶生物工程（大連）有限公司；Gel Extraction Kit購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，去離子水溶解，-20 ℃保存。

以人類MBF1基因序列為探針，利用NCBI中BLAST工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，篩選豬的同源性EST序列（長度≥200 bp，相似性≥80%），用DNAStar軟件包中的SeqMan程序進行EST序列拼接，參照拼接的Contig采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物M1F/M1R、M2F/M2R兩對引物擴增MBF1基因的cDNA序列，參照MBF1基因的cDNA序列設(shè)計M3F/M3R、M4F/M4R兩對引物擴增MBF1基因的全序列，采用引物M3F/M3R進行基因表達(dá)譜分析（表1）。

1.3 PCR擴增與克隆

PCR擴增體系為25 μL，體系中各組分的濃度為50 ng 模板DNA（cDNA）、2×PCR mix、0.5 mmol/L PCR primers。PCR擴增程序為： 94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性 45 s，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s， 35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶用Gel Extraction Kit 試劑盒純化回收，回收后的PCR產(chǎn)物與pMD-18T vector system連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并將陽性克隆送至北京奧科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 組織表達(dá)譜分析

提取4月齡大白豬肝、心、腎、脂肪、肌肉、胃、小腸、肺、脾、子宮、卵巢11個組織的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以豬管家基因GAPDH （6-磷酸甘油醛脫氫酶）為內(nèi)參基因，引物為GAPDHF/GAPDHR（表1）。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s， 58 ℃退火50 s， 72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴增結(jié)果

利用引物M1F、M1R，M2F/M2R擴增出大白豬MBF1基因序列，將PCR產(chǎn)物回收純化克隆測序，測序結(jié)果表明，引物M1F/M1R擴增片斷長度為617 bp，引物M2F/M2R擴增片斷長度為274 bp（圖1）。

2.2 豬MBF1基因cDNA序列分析

利用DNAStar軟件的SeqMan程序?qū)T-PCR擴增得到的片段進行拼接，得到一條長875 bp的cDNA序列，將獲得的豬cDNA序列分別與人MBF1基因cDNA序列（GenBank登錄號： NM_003792）和小鼠序列（GenBank登錄號：NM_021519）進行比對。結(jié)果表明，豬MBF1基因與人、小鼠的相似性分別為89%和88%，確定所獲取的序列為豬的MBF1基因，含有一個447 bp的開放閱讀框。

2.3 豬MBF1蛋白與部分物種MBF1的進化關(guān)系

利用GenBank已有的MBF1蛋白質(zhì)序列：NP_003787（MBF1，Huamn）、NP_067494（MBF1，Mouse）、

NP_001006203（MBF1，Gallus）、NP_001016686（MBF1，

Xenopus tropicalis）、NP_957039（MBF1，Zebrafish）以及預(yù)測的豬MBF1基因編碼氨基酸，利用ClustalW軟件對6個物種的USF1蛋白進行了序列比對。結(jié)果表明，豬編碼的氨基酸序列與人、小鼠、雞、非洲爪蟾、斑馬魚的相似性分別為99%、97%、92%、88%、82%，并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖2）。

2.4 豬MBF1基因全序列的克隆與序列分析

根據(jù)人類MBF1基因全序列，參照分離得到的豬MBF1基因序列，設(shè)計M3F/M3R、M4F/M4R兩對引物，以大白豬基因組DNA為模板擴增豬MBF1基因的內(nèi)含子序列，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果如圖3。

對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果表明，引物M3F/M3R在豬基因組中的擴增片斷長度是753 bp，其中第2內(nèi)含子的長度為355 bp， 第3內(nèi)含子的長度為197 bp；引物M4F/M4R在豬基因組中的擴增片斷長度579 bp，其中第4內(nèi)含子的長度為492 bp。將序列拼接獲得的1 919 bp的豬MBF1基因組序列，提交到GenBank收錄號為EF 625885；通過內(nèi)含子、外顯子、邊界分析發(fā)現(xiàn)豬MBF1基因的內(nèi)含子的剪接方式都符合“GT-AG”法則（圖4）。

2.5 豬MBF1基因的組織表達(dá)譜分析

利用特異引物M3F/M3R，并將GAPDH作為對照，以各個組織cDNA為模板進行半定量RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物長度分別為261 bp和480 bp（圖5）。結(jié)果表明，MBF1基因在心、肝、脾、腎、子宮中表達(dá)量較高，在肺、胃、脂肪、脂肪、肌肉、卵巢中等表達(dá)，在胃和小腸中表達(dá)量較低。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明豬MBF1基因的cDNA序列與人和小鼠序列的相似性分別為89%和88%，MBF1基因編碼的蛋白質(zhì)序列與人和小鼠的蛋白質(zhì)序列相似性分別為99%和97%。編碼區(qū)的高度保守性和蛋白質(zhì)序列的高度相似性證實了所分離基因的正確性，同時也為利用人、小鼠等模式動物的基因信息來進行畜禽基因組學(xué)的研究提供依據(jù)。

動物間的基因結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，根據(jù)已知物種的基因組結(jié)構(gòu)，可以預(yù)測其他物種同源基因的結(jié)構(gòu)。本研究利用人MBF1基因結(jié)構(gòu)，預(yù)測了豬MBF1基因結(jié)構(gòu)，并通過試驗的方法獲得了相應(yīng)的基因組序列，所獲得的候選基因的內(nèi)含子和外顯子組成及相對位置與預(yù)測結(jié)果一致，且內(nèi)含子的剪切方式均符合“GT-AG”法則。本研究分離的MBF1基因與人相應(yīng)的基因具有相同的基因組結(jié)構(gòu)，這也印證了基因組結(jié)構(gòu)在不同物種間的高度保守性，同時也說明根據(jù)已知物種基因組結(jié)構(gòu)來預(yù)測其他物種同源基因結(jié)構(gòu)的可行性。

參考文獻：

[1] TAKEMARU K， LI F Q， UEDA H， et al. Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is an evolutionarily conserved transcriptional coactivator that connects regulatory factor and TATA element-binding protein[J]. Proc Natl Acad Sci，1997，94：7251-7256.

[2] TAKEMARU K， HARASHIMA S， UEDA H， et al. Yeast coactivator MBF1 mediates GCN4-dependent transcriptional activation [J]. Mol Cell Bio，1998，18：4971-4976.

[3] OZAKI J， TAKEMARU K， IKEGAMI T， et al. Identification of the core domain and the secondary structure of the transcriptional coactivator MBF1[J]. Genes Cells，1999，4：415-424.

[4] BRENDEL C， GELMAN L， AUWERX J. Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is coactivator for nuclear receptors that regulate lipid metabolism[J]. Mol Endocrinol，2002，16：1367-1377.

[5] LIU Q X， JINDRA M，UEDA H，et al. Drosophila MBF1 is coactivator for tracheae defective and contributes to the formation of tracheal and nervous system[J]. Development，2003， 130：729-728.

[6] KABE Y， GOTO M， SHIMA D， et al. The role of human MBF1 as a transcriptional coactivator[J]. J Bio Chem，1999， 274：34196-34202.