陶虎　熊琪　李曉峰　索效軍　張年　楊前平　劉洋　陳明新

摘要：DKK2基因是Wnt信號通路的關(guān)鍵抑制因子，在胚胎發(fā)育、顆粒細(xì)胞生成等過程中發(fā)揮重要作用。擴(kuò)增了牛DKK2基因CDS序列，構(gòu)建了DKK2基因pcDNA3.1真核表達(dá)載體；為進(jìn)一步驗(yàn)證載體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效果，將表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，利用qRT-PCR和Western blot檢測DKK2的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DKK2基因的真核表達(dá)載體質(zhì)粒，其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著上升，表明已成功構(gòu)建了DKK2基因表達(dá)載體，為下一步開展DKK2基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牛；DKK2基因；pcDNA3.1表達(dá)載體；細(xì)胞轉(zhuǎn)染；基因超表達(dá)

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5751-03

Abstract：DKK2 gene is the key inhibitory factor of the Wnt signaling pathways， and plays an important role in the process of embryonic development， granular cell generation and so on. This study amplified the CDS sequence of cow DKK2 gene and built its pcDNA3.1 eukaryotic，then verified the correctness by enzyme digestion and sequencing. In order to further verified the expressing effect of this expression vector in cells， the vector was transfected into CHO cells transiently， then DKK2 expression was detected by using qRT-PCR and Western blot. The results showed that the mRNA and protein expressions of DKK2 gene were significantly increased in CHO cells， and indicated the pcDNA3.1 of DKK2 gene had been successfully constructed. This laid the foundation of the next step of DKK2 gene function research.

Key words： cow； DKK2 gene； pcDNA3.1 expression vector； infected cells； gene overexpression

哺乳動物卵泡的發(fā)育過程非常復(fù)雜，并且與家畜的繁殖性能緊密關(guān)聯(lián)。利用超聲掃描等手段，對家畜卵泡的發(fā)育模式進(jìn)行了較為深入的研究，但對卵泡發(fā)育的調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步的研究。對調(diào)控規(guī)律的研究有助于分析家畜繁殖性能的分子機(jī)制，對于生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

DKK蛋白家族包含DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，均為分泌性糖蛋白[1]。DKK蛋白通過結(jié)合LRP5/6，抑制Wnt信號通路來發(fā)揮調(diào)控作用[2，3]。DKK2基因與胚胎著床及子宮內(nèi)膜蛻膜化過程密切相關(guān)[4，5]。DKK2基因敲除的小鼠能正常生育，但個體小于同窩的其他小鼠[6，7]。此外，DKK2基因可調(diào)控上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可作為蛻膜的標(biāo)記物[8]。由此可見，DKK2基因在雌性哺乳動物繁殖過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但尚未見到該基因調(diào)控卵泡發(fā)育分子機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本研究采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了牛DKK2基因pcDNA3.1表達(dá)載體，為開展DKK2基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣本取自牛肌肉組織；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和pcDNA3.1表達(dá)載體由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；質(zhì)粒pMD18-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶及高保真DNA聚合酶購自NEB公司；DKK2抗體購自Abcam公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DKK2基因CDS序列的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中DKK2基因cDNA已知序列，設(shè)計(jì)合成引物，并在引物5端和3端分別引入了NheⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)。正向引物為5-CTAGCTAGCGCCACCATGGCCGTGTTGATGCGG-3，反向引物為5-CCCAAGCTTTCATATTTTCTGGCATACATGGA-3，以DKK2基因cDNA為模板。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片斷大小為780 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性30 s + 62 ℃變性30 s + 72 ℃變性1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。所用酶為Taq Plus DNA Polymerase。PCR儀為Mini CyclerTM基因擴(kuò)增儀。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，具體操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.2 克隆載體的構(gòu)建 所用載體為pMD18-T Vector，可進(jìn)行酶切鑒定和測序。連接反應(yīng)體系為：8 μL純化后的PCR產(chǎn)物、1 μL 10×Ligation Buffer、 1 μL pMD18-T Vector，于16 ℃金屬浴條件下連接4 h。取10 μL連接產(chǎn)物，加入50 mL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，輕輕吸打混勻，冰浴5 min，42 ℃熱擊45 s。將混合體系用無菌涂布棒均勻涂布于含Amp（氨芐）的LB固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 在培養(yǎng)皿上隨機(jī)挑取10個單菌落，分別接種于1.5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 h。挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，和pcDNA3.1質(zhì)粒一并進(jìn)行NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切。利用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，16 ℃條件下連接4 h后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用含有Amp的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆。以菌液為模板，利用通用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測目的片段大小，將陽性菌液送至北京奧科生物科技公司測序，測序正確的克隆提取質(zhì)粒備用。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及DKK2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞系）細(xì)胞系由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存，細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-F12中加入10%的胎牛血清，培養(yǎng)箱條件為5% CO2、37 ℃。待細(xì)胞培養(yǎng)至80%的融合度，使用胰酶消化后均勻接種于6孔板中。每孔加入100 μL的lipofectmin 2 000和DKK2表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)合物于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后提取RNA，48 h提取總蛋白，均-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 DKK2基因表達(dá)分析 將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并設(shè)計(jì)定量引物DL-PF：5ATCTGCGGGCACATACCA3，DL-PR：5CTCCCAACTTCACATTCCT TA3；采用qRT-PCR檢測超表達(dá)DKK2基因的CHO細(xì)胞中該基因表達(dá)量。將總蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完畢后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，DKK2抗體4 ℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后經(jīng)ECL試劑盒曝光顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛DKK2基因編碼區(qū)擴(kuò)增

取牛肌肉組織提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增DKK2基因的CDS序列。經(jīng)凝膠電泳結(jié)果顯示，片段長度與預(yù)期結(jié)果相符（DKK2的CDS長度為780 bp），并未出現(xiàn)非特異性條帶（圖1）。

2.2 DKK2基因表達(dá)載體的構(gòu)建

DKK2基因CDS序列的PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體經(jīng)NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，切膠回收。利用T4連接酶，連接載體和CDS序列的雙酶切產(chǎn)物，并克隆轉(zhuǎn)化入DH5α，培養(yǎng)過夜后挑選陽性克隆進(jìn)行鑒定。

2.2.1 雙酶切鑒定 陽性克隆質(zhì)粒采用NheⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，酶切后分別釋放出相應(yīng)大小的特異性條帶（圖2），結(jié)果與預(yù)期相符。

2.2.2 測序鑒定 將陽性菌液送公司測序，所得結(jié)果通過序列比對軟件BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiCMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome）

進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，目的片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中提交的片段序列完全一致（圖3）。

2.3 qRT-PCR和Western blot檢測重組質(zhì)粒表達(dá)

將表達(dá)載體pc-DKK2瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h提取RNA，48 h后提取總蛋白質(zhì)，分別利用qRT-PCR和Western blot檢測重組質(zhì)粒表達(dá)情況。結(jié)果表明，過表達(dá)DKK2基因后，CHO細(xì)胞中DKK2基因的mRNA表達(dá)量升高了17 782倍，效果極顯著（P<0.001），在蛋白質(zhì)水平較之于pcDNA3.1空載體組顯著升高（P<0.05），說明表達(dá)載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3 小結(jié)與討論

本研究通過擴(kuò)增牛DKK2基因的CDS全長序列，通過雙酶切并回收目的序列，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了DKK2基因的pcDNA3.1表達(dá)載體；然后利用雙酶切凝膠電泳和測序技術(shù)驗(yàn)證擴(kuò)增序列的正確性；最終在CHO細(xì)胞中進(jìn)行了質(zhì)粒的表達(dá)驗(yàn)證，所得到的質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)DKK2基因功能的試驗(yàn)研究。

綜合前人研究，卵泡顆粒細(xì)胞可分泌性腺激素，具有支持卵泡的作用，能夠維持卵巢正常功能[9，10]。圍繞卵丘的顆粒細(xì)胞構(gòu)建了細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，與卵泡進(jìn)行物質(zhì)和信號交換，其中雌激素的分泌最為重要[11]。由此可見，顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。Wnt信號通路極為保守，在哺乳動物生長發(fā)育、疾病、衰老等過程中發(fā)揮重要作用[12，13]。Wnt信號通路在顆粒細(xì)胞增殖分化和母性生殖過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[14]。Li等[15]研究表明，Wnt信號通路對卵泡發(fā)育起負(fù)調(diào)控作用，其通過對轉(zhuǎn)錄因子Foxo3的激活影響顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡類固醇的合成。

DKK2作為Wnt信號通路重要的抑制因子，在哺乳動物繁殖過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但尚未見到DKK2基因調(diào)控牛顆粒細(xì)胞增殖分化的相關(guān)報(bào)道。DKK2基因在物種中保守性很高，在人、小鼠、牛、山羊和豬中CDS序列相似度高。本研究通過成功構(gòu)建牛DKK2基因的pcDNA3.1表達(dá)載體，可為研究DKK2調(diào)控牛顆粒細(xì)胞發(fā)育的具體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] NIEHRS C. Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators[J]. Oncogene， 2006， 25： 7469-7481

[2] BROTT B K， SOKOL S Y. Regulation of Wnt/LRP signaling by distinct domains of Dickkopf proteins[J]. Mol Cell Biol， 2002，22：6100-6110.

[3] DING Y， SHEN S Q， LINO A C， et al. Beta-catenin stabilization extends regulatory T cell survival and induces anergy in nonregulatory T cells[J]. Nature Medicine，2008，14：162-169.

[4] ZHANG Y， PENG S， KUANG H， et al. Expression and regulation of Dickkopf-2 during periimplantation in mice[J]. J Reprod Dev，2009，55：17-22.

[5] CHEN L， WANG K， SHAO Y， et al. Structural insight into the mechanisms of Wnt signaling antagonism by Dkk[J]. J Biol Chem， 2008， 283： 23364-23370.

[6] LI X， LIU P， LIU W， et al. Dkk2 has a role in terminal osteoblast differentiation and mineralized matrix formation[J]. Nat Genet， 2005， 37： 945-952.

[7] MUKHOPADHYAY M， GORIVODSKY M， SHTROM S， et al. Dkk2 plays an essential role in the corneal fate of the ocular surface epithelium[J]. Development，2006，133：2149-2154.

[8] BODINE P V， KOMM B S. Wnt signaling and osteoblastogenesis[J]. Rev Endocr Metab Disord，2006，7：33-39.

[9] FAN HY， LIU Z， SHIMADA M， et al. MAPK3/1 （ERK1/2） in ovarian granulosa cells are essential for female fertility[J]. Science，2009，324（5929）：938-941.

[10] VAN DEN HURK R， ZHAO J. Formation of mammalian oocytes and their growth， differentiation and maturation within ovarian follicles[J]. Theriogenology，2005， 63（6）：1717-1751.

[11] NELSON L R， Bulun SE. Estrogen production and action[J]. J Am Acad Dermatol， 2001， 45：8116-8124.

[12] MILLER J R. The Wnts[J]. Genome Biol，2002，3（1）：3001.

[13] HUANG H， HE X. Wnt/beta-catenin signaling： New （and old） players and new insights[J].Curr Opin Cell Biol， 2008， 20（2）：119-125.

[14] WANG S B， XING B S， YI L， et al. Expression of Frizzled 2 in the mouse ovary during oestrous cycle[J]. J Anim Physiol Anim Nutr （Berl）， 2010， 94（4）：437-445.

[15] LI L， JI SY， YANG J L， et al. Wnt/β-catenin signaling regulates follicular development by modulating the expression of Foxo3a signaling components[J]. Mol Cell Endocrinol， 2014， 382（2）：915-925.

（責(zé)任編輯 屠 晶）