高 峰張 振康曉魁李 佳李 帆任新亮張利通靳張寧董文濤楊新宇

Hes1與小鼠海馬齒狀回神經(jīng)再生*

高 峰①張 振①康曉魁①李 佳①李 帆②任新亮②張利通①靳張寧①董文濤①楊新宇①

目的：觀察幼年小鼠與成年小鼠海馬齒狀回中Hes1的表達差異，初步分析其對成年神經(jīng)再生的影響。方法：將C57BL/6雄性小鼠分為幼年組（10 d，N組）和成年組（4個月，A組），每組8只。分別對Hes1、BrdU、Doublecortin（DCX）、NeuN采用免疫熒光技術染色并進行相應的細胞計數(shù)，初步分析BrdU、Hes1雙陽性細胞的細胞類型及表達水平。在顯微鏡下分離海馬齒狀回，采用Western blot檢測Hes1的蛋白水平，觀察對比兩組間Hes1蛋白表達的差異。結果：（1）Western blot檢測中A組中的Hes1蛋白的表達水平明顯高于N組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（2）Hes1（+）細胞主要分布于齒狀回顆粒細胞下層，并且大部分Hes1陽性細胞同時表達Brdu；（3）A組Hes1（+）細胞數(shù)量明顯多于N組，而BrdU（+）細胞明顯少于N組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：Hes1在幼年小鼠與成年小鼠齒狀回顆粒細胞下層中的表達差異，導致了神經(jīng)細胞增殖水平的不同，表明Hes1的高表達可能抑制了神經(jīng)再生。

Hes1； 齒狀回； 神經(jīng)再生

成年大腦仍然存在著神經(jīng)再生，這一觀點目前已得到了廣泛的認可。之前的研究表明神經(jīng)元生成的兩個主要部位分別為海馬齒狀回的顆粒細胞下層（SGZ）與側腦室室管膜下區(qū)（SVZ）[1]。神經(jīng)再生是一個主動調節(jié)的連續(xù)過程，包括多能干細胞的增值、分化、遷移和成熟[2-3]。在發(fā)育過程中，表達于海馬齒狀回中的神經(jīng)前體細胞中的堿性螺旋-環(huán)-螺旋基因（basic Helix-Loop-Helix genes， bHLH genes），在成年神經(jīng)再生中起著至關重要的作用[4-5]。Hes1作為bHLH基因的轉錄因子之一，其表達可能會抑制多能干細胞的增殖和神經(jīng)再生[6]。本文以神經(jīng)再生活躍的新生小鼠（10 d）作為對照，檢測成年小鼠中Hes1的表達，進一步闡明Hes1的表達與成年神經(jīng)再生的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取16只C57BL/6雄性小鼠，分為以下兩組：（10 d，N組）幼年組和（4個月，A組）成年組，每組8只小鼠，并且成年組小鼠在動物室飼養(yǎng)10 d以適應環(huán)境。

1.2 BrdU給藥方法與標本制備 兩組小鼠均以BrdU 50 mg/kg腹腔注射給藥3 d，2次/d，每次間隔12 h，最后一次注射2 h后予戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，經(jīng)升主動脈灌注生理鹽水100 mL，4％多聚甲醛液（pH 7.4）500 mL后，斷頭取腦，將腦組織置入4％多聚甲醛固定過夜，20％蔗糖4 ℃沉底。選擇海馬部位應用冰凍切片機冠狀位連續(xù)切片，腦片厚度為35 μm，每隔140 μm取一張腦片，將腦片放入防凍液中保存以備用。

1.3 免疫熒光染色 通過免疫熒光染色方法對Hes1、BrdU、Doublecortin（DCX）、NeuN染色并進行細胞計數(shù)。具體步驟如下：用0.01 mmol/L PBS漂洗組織切片5 min×3次，后加入2 mol/L HCL室溫下變性1 h，用0.1 mmol/L檸檬酸鈉中和10 min，80 ℃下抗原修復0.5 h，待其恢復到室溫，繼續(xù)PBS液漂洗組織切片5 min×3次，加入0.5％ Triton和馬血清的混合封閉液中室溫下?lián)u床1 h。吸去原有封閉液，再次加入封閉液，依次按比例加入一抗，4 ℃反應48 h，PBS洗3次，5 min/次，轉入0.5％ Triton中，避光條件下，分別按比例加入二抗，37 ℃反應1 h，PBS洗3次，5 min/次，避光鋪片、甘油封片，最后在熒光顯微鏡下觀察腦片。

1.4 細胞計數(shù) 所有小鼠隨機選取6個非連續(xù)的腦片進行細胞計數(shù)，熒光顯微鏡下觀察小鼠齒狀回顆粒細胞下層BrdU與Hes1雙陽性細胞數(shù)，以及Hes1與其他細胞標記蛋白的表達。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0軟件包行統(tǒng)計學分析，計量資料采用（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組海馬齒狀回組織中Hes1蛋白的表達情況比較 Western Blot檢測結果顯示，N組和A組中均有Hes1基因的表達，見圖1。經(jīng)過與β-actin內參相比較，A組中蛋白表達（0.40）明顯高于N組（0.21），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 Western Blot檢測海馬齒狀回組織中Hes1蛋白的表達情況

2.2 Hes1在小鼠海馬齒狀回的分布 通過對Hes1進行免疫熒光染色顯示，Hes1主要表達在齒狀回的顆粒細胞的下層。與N組相比，A組中Hes1陽性的細胞數(shù)明顯增多。同時，通過對Hes1進行免疫熒光染色，其表達水平與BrdU一致，且局限于SGZ，圖2A和D。免疫熒光染色表明，僅部分Hes1蛋白表達于DCX陽性細胞（未成熟神經(jīng)元），但不表達于NeuN陽性細胞（成熟神經(jīng)元）。

2.3 神經(jīng)干細胞增殖情況 Hes1與BrdU的合并染色表明，只有部分BrdU陽性細胞與Hes1陽性細胞重合，但是幾乎所有Hes1陽性細胞均為BrdU陽性，見圖2 C和F。BrdU陽性細胞數(shù)量可以代表海馬齒狀回顆粒細胞下層神經(jīng)再生水平。筆者的實驗結果表明，幼年小鼠中BrdU陽性細胞數(shù)（3336±63）個明顯高于成年小鼠（347±16）個，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

3 討論

包括人類在內的成年哺乳動物整個生命過程中都存在著神經(jīng)再生，這一事實目前已得到了廣泛的認可。近些年的研究已經(jīng)表明，Notch信號通路在神經(jīng)干細胞的自我更新、增殖、分化中發(fā)揮著重要作用[7-8]。Notch-Hes信號傳導通路中靶基因Hes1，是調節(jié)哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的bHLH基因的轉錄因子之一，其可能對神經(jīng)元的分化起著負調控的作用[6]。相關研究表明，神經(jīng)元生成水平會隨著年齡的增加而逐漸下降，C57/BL6小鼠DG增長在出生后的前7 d相對緩慢，7～14 d增長加快，而后增長速度又再次減緩，到3個月趨于穩(wěn)定，所以，齒狀回顆粒細胞下層的神經(jīng)元生長在幼年小鼠中處于活躍期[9]。筆者通過免疫細胞化學染色方法發(fā)現(xiàn)，海馬齒狀回中成年小鼠BrdU陽性細胞數(shù)量明顯少于幼年小鼠，表明幼年小鼠神經(jīng)元生成的數(shù)量顯著多于成年小鼠。Western Blot顯示，與幼年小鼠相比，成年小鼠海馬齒狀回顆粒細胞下層的Hes1表達明顯增加。相關體外實驗表明，Hes1的表達抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)前體細胞的增殖和神經(jīng)再生[10]。因此筆者推測，Hes1在幼年與成年小鼠齒狀回顆粒細胞下層中的表達差異，導致了神經(jīng)細胞增殖水平的不同，表明Hes1的高表達可能抑制了神經(jīng)再生。另外，筆者還進行了Hes1與DCX、NeuN的雙染色，發(fā)現(xiàn)Hes1的表達局限在海馬齒狀回的顆粒細胞下層，部分表達于DCX陽性細胞（未成熟神經(jīng)元）但不表達與NeuN陽性細胞（成熟神經(jīng)元），所以筆者猜測，Hes1可能只表達于增殖和分化狀態(tài)下的神經(jīng)前體細胞。研究表明，Hes1的震蕩表達可以抑制Ngn2的表達[11]。筆者之前的研究表明，新生神經(jīng)元數(shù)量明顯減少可能是由于成年個體Ngn2的低表達導致的[12]。因此筆者推測，Hes1通過抑制Ngn2的表達而間接地抑制神經(jīng)再生。

圖2 幼年與成年小鼠海馬齒狀回Brdu/Hes1免疫熒光雙重染色注：在海馬齒狀回中幼年小鼠BrdU（+）（綠色）細胞數(shù)明顯多于成年小鼠（B、E）；同時，Hes1（紅色）的表達在兩組之間存在明顯差異（A、D），且Hes1（+）細胞只局限于SGZ；但是，并非所有Brdu（+）細胞均表達Hes1（C、F）

但是，成年小鼠海馬齒狀回顆粒細胞下層中的Hes1是通過什么機制激活的，目前尚無相關研究。激活后的Hes1是如何抑制Ngn2表達的，目前尚無定論，通過下調Hes1的表達能否促進神經(jīng)再生，這些都是有待筆者進一步研究的問題。

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The Relationship Between Hes1 Expression and Adult Neurogenesis of Dentate Gyrus in Mice/

GAO Feng，ZHANG Zhen，KANG Xiao-kui，et al./Medical Innovation of China，2015，12（10）：015-018

Objective：To investigate the effect of Hes1 on adult neurogensis from the level of neurogenesis and Hes1 expression in dentate gyrus of hippocampus between neonatal mice and adult mice.Method：The C57BL/6 male mice were separated into two groups：the newborn mice was as control for neonatal group（10 days old，N group），and the adult mice （4 months old， A group） were assigned to adult group，8 mice in each group.The immunofluorescence staining of Hes1，Brdu，Doublecortin （DCX） and NeuN were performed and the cell count was corresponding recorded，double positive cells types and level of expression were preliminary analyzed of Brdu，Hes1.The hippocampal dentate gyrus was separated in microscope，Hes1 protein levels were detected by Western blot， the differences of two groups’Hes1 protein expression levels were observed and compared.Result：（1）Hes1 protein levels of A group was hingher than the N group from Western blot detection，the difference was statistically significant（P＜0.05）；（2）Hes1 positive cells mainly distributed in the dentate gyrus granular cell lower， and most Hes1 positive cells expressed Brdu at the same time；（3）the group A of Hes1（+） cells significantly was more than N group， and BrdU（+） obviously less than N group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：The different expression of Hes1 from neonatal mice and adult mice in dentate gyrus of hippocampus，lead to different neurons generated levels， indicating high expression of Hes1 may inhibit neurogenesis.

Hes1； Dentate Gyrus； Neurogenesis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.10.005

2014-12-24） （本文編輯：周亞杰）

國家自然科學基金（30973090）；山西省自然科學基金面上項目（2014011041-8）

①天津醫(yī)科大學總醫(yī)院、天津市神經(jīng)病學研究所、天津市神經(jīng)損傷變異與再生重點實驗室 天津 300052

②山西省長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院

楊新宇

First-author’s address：Tianjin Medical University General Hospital；Tianjin Neurology Institute；Tianjin Key Laboratory of Injuries Variations and Regeneration of Nervous System，Tianjin 300052，China