李永富馮 星

缺氧缺血性腦病新生兒外周血淋巴細(xì)胞鐘基因表達(dá)的變化*

李永富①馮 星②

目的：通過(guò)比較足月缺氧缺血性腦病患兒與正常足月新生兒外周靜脈血中淋巴細(xì)胞（Peripheral blood lymphocytes cell，PBLC）中鐘基因Clock mRNA、Bmal1 mRNA含量水平的變化，研究探討HIE所致的晝夜節(jié)律紊亂中對(duì)鐘基因的影響。方法：采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）測(cè)定32例缺氧缺血性腦病患兒（HIE組）與24例正常足月新生兒（對(duì)照組）外周血淋巴細(xì)胞中Clock mRNA、Bmal1 mRNA的含量，并比較各組之間的差異。結(jié)果：HIE組外周血淋巴細(xì)胞中Clock mRNA和Bmal1 mRNA 的水平均低于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HIE組外周血淋巴細(xì)胞中Clock mRNA、Bmal1 mRNA含量的變化趨勢(shì)基本一致。結(jié)論：HIE患兒PBLC中Clock mRNA、Bmal1 mRNA表達(dá)存在異常，兩者可能在缺氧缺血后晝夜節(jié)律紊亂的發(fā)生起著一定的作用。

腦缺氧； 腦缺血； 新生兒； 外周血淋巴細(xì)胞； 鐘基因

缺氧缺血性腦?。℉ypoxic–ischemic encephalopathy，HIE）是指兒科臨床上常見(jiàn)的一種嚴(yán)重疾病，在新生兒中的患病率約為3‰～6‰，其中15％～20％在新生兒期死亡，其余約1/4～1/3會(huì)存在不同類型和程度的遠(yuǎn)期后遺癥，成為危害我國(guó)兒童生活質(zhì)量的重要疾病之一[1]。HIE的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不僅存在電解質(zhì)、血糖等內(nèi)環(huán)境改變，相關(guān)遞質(zhì)受體的變化、細(xì)胞凋亡等，在缺氧后，患兒的血壓節(jié)律也發(fā)生紊亂，說(shuō)明生物節(jié)律的變化也參與其中，成為了當(dāng)前兒科臨床研究的重點(diǎn)之一[2-4]。筆者希望通過(guò)研究HIE患兒外周靜脈血淋巴細(xì)胞中Clock mRNA和Bmal1 mRNA的含量水平變化來(lái)探討HIE中鐘基因的變化及影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）選取2012年6月-2013年11月在蘇州兒童醫(yī)院新生兒科和蘇州市立醫(yī)院本部新生兒科住院治療的HIE患兒32例為HIE組，均符合《實(shí)用新生兒學(xué)》（第4版）中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）選取24例同時(shí)期在蘇州兒童醫(yī)院新生兒科和蘇州市立醫(yī)院本部新生兒科住院治療的患兒為窒息組，出生時(shí)1 min Apgar評(píng)分＜3分，5 min Apgar評(píng)分＜5分，但臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查等均不符合缺氧缺血性腦病[5]。上述患兒胎齡在37+1～41+4周，出生體重為2650～3900 g。（3）選取2012年8月-2013年11月在蘇州市市立醫(yī)院本部產(chǎn)科正常分娩的健康足月新生兒32例為對(duì)照組，胎齡在37～41+5周，出生體重為2550～3950 g。上述患兒均在出生24 h內(nèi)采取外周靜脈血3 mL，為盡量避免時(shí)間因素影響，采血時(shí)間為上午9～12時(shí)。三組患兒在胎齡、出生體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 三組患兒的胎齡、出生體重比較（±s）

表1 三組患兒的胎齡、出生體重比較（±s）

組別胎齡（周）出生體重（g）HIE組（n=32）39.26±1.533514.35±406.27窒息組（n=24）41.02±1.653376.89±471.98對(duì)照組（n=32）39.54±1.543199.55±503.42 F值0.22550.0880 P值0.79860.9158

1.2 儀器與試劑 美國(guó)Perkin Elmer儀器有限公司96孔溫度梯度PCR擴(kuò)增儀（GeneAmp PCR system 9600）；美國(guó)BIO-RAD公司電泳系統(tǒng)（170-3930 Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell）；日本三洋-60 ℃低溫冰箱；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，上海華精生物高科技有限公司；TRIzol Reagent：Invitrogen Life Technologies。

1.3 PCR引物 PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Clock和Bmal1 mRNA及內(nèi)對(duì)照β-actin的上、下游引物如下：

內(nèi)對(duì)照β-actin引物：（產(chǎn)物大小227 bp）：上游引物P1 5'-GTA AAG ACC TCT ATG CCA ACA-3'；下游引物P2 5'-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT-3'。

Clock引物：（產(chǎn)物大小433 bp）：上游引物P5 5'-CAG GGC ACC ACC CAT AAT–3'；下游引物P6 5'-CCG AGA AGA GGC AGA AGG-3'。

Bmal1引物：（產(chǎn)物大小309 bp）：上游引物P3 5'-GTA GGT TAG TGG TGC GAC AT-3'；下游引物P4 5'-GCT TGG GAG GAG TTA GGG-3'。

1.4 RNA提取及RT-PCR過(guò)程 抗凝全血分離出淋巴細(xì)胞后，采用TRIzol Reagent提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成CDNA后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上?biāo)本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后將凝膠在0.5％溴化乙錠（EB）顯色劑中染色30 min，放在紫外光檢測(cè)儀進(jìn)行觀察，采用Image pro-plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果數(shù)碼拍照進(jìn)行圖像分析，然后用Image-pro plus測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照對(duì)比，半定量分析Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量，對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SAS 9.3醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患兒PBLC中Clock mRNA表達(dá)水平比較 HIE組患兒中Clock mRNA含量為（0.6511±0.1973），對(duì)照組為（0.7814±0.1426），窒息組為（0.7283±0.1094）。HIE組患兒中Clock mRNA含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.028，P＜0.05）；窒息組患兒中Clock mRNA含量與對(duì)照組比較有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.518，P＞0.05）；HIE組患兒中Clock mRNA含量較窒息組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.726，P＜0.05）。三組患兒Clock mRNA的相關(guān)表達(dá)見(jiàn)圖1～3。

圖1 三組患兒PBLC中Clock mRNA表達(dá)水平柱形圖

圖2 HIE組與窒息組Clock mRNA PCR電泳圖

圖3 對(duì)照組Clock mRNA PCR電泳圖

2.2 三組患兒PBLC中Bmal1 mRNA表達(dá)水平比較 HIE組Bmal1 mRNA含量為（0.5664±0.2875），窒息組為（0.6267±0.2183），對(duì)照組為（0.7261±0.2451）。HIE組Bmal1 mRNA含量明顯降低，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.391，P＜0.05）；窒息組中Bmal1 mRNA表達(dá)水平比對(duì)照組略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.573，P＞0.05）；HIE組Bmal1 mRNA含量較窒息組低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.858，P＞0.05）。三組患兒PBLC中Bmal1 mRNA相關(guān)表達(dá)見(jiàn)圖4～6。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)HIE患兒PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在缺氧缺血后發(fā)生了變化，進(jìn)一步證明了缺氧缺血能對(duì)人體生物節(jié)律造成影響。筆者知道，在人類生物節(jié)律中樞（SCN）和多種外周組織中均有多種生物鐘基因的的表達(dá)[6]。而且，進(jìn)一步的研究證明，人類胎兒的SCN對(duì)光已有反應(yīng)，而且外周生物鐘組織已開(kāi)始形成，而且在出生前胎兒期就已經(jīng)初步形成晝夜節(jié)律；另外，也發(fā)現(xiàn)了時(shí)間因素可以影響新生兒的外周血單個(gè)核細(xì)胞中Bmal1基因的表達(dá)[7-9]。而且，缺氧缺血作為一個(gè)獨(dú)立的因素，可以影響動(dòng)物松果體中的鐘基因表達(dá)，因此，外周生物鐘組織之一的外周血淋巴細(xì)胞中的鐘基因也應(yīng)該發(fā)生相應(yīng)的變化，在筆者的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖4 三組患兒PBLC中Clock mRNA表達(dá)水平柱形圖

圖5 HIE組與窒息組Bmal1 mRNA PCR電泳圖

圖6 對(duì)照組Bmal1 mRNA PCR電泳圖

3.1 缺氧缺血性腦病對(duì)PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量水平的影響 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生缺氧缺血性腦病后，HIE組PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量比對(duì)照組降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），筆者分析認(rèn)為，其原因可能與缺氧缺血后血漿中的褪黑素濃度水平發(fā)生了變化有關(guān)系。動(dòng)物研究表明，褪黑素作為組織細(xì)胞間的化學(xué)信使，對(duì)各種生物鐘基因起到調(diào)節(jié)作用，其釋放入血的晝夜變化規(guī)律和Clock mRNA的表達(dá)水平變化幾乎一致，同樣，Clock和Bmal1基因的表達(dá)也受到褪黑素濃度的影響[10-11]。研究同樣證明了嬰兒松果體分泌的褪黑素參與調(diào)控人體的晝夜節(jié)律[12]。在缺氧缺血性腦病患兒，嚴(yán)重的缺氧缺血損傷了SCN神經(jīng)細(xì)胞和松果體，導(dǎo)致代謝紊亂，從而抑制褪黑素的合成以及向外周血的分泌，這種變化和年齡有關(guān)[13-14]。外周血中褪黑素水平的下降，抑制了PBLC中鐘基因的轉(zhuǎn)錄，Clock mRNA和Bmal1 mRNA的含量也隨之降低。

通過(guò)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)，筆者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生HIBD新生大鼠松果體中的CLOCK、BMAL1合成發(fā)生了明顯的改變，同樣證實(shí)了缺氧缺血能夠影響Clock mRNA和Bmal1 mRNA的表達(dá)[15]。

另外，在缺氧缺血性腦病患兒PBLC中，Clock mRNA和Bmal1 mRNA含量水平相比窒息組患兒下降更為明顯。筆者推測(cè)，PBLC中，生物鐘基因表達(dá)不僅僅受缺氧缺血因素的影響，發(fā)生HIE后，神經(jīng)細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重，出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡和內(nèi)環(huán)境較大改變，進(jìn)一步影響了生物鐘Clock和Bmal1基因的表達(dá)。

3.2 Clock和Bmal1與缺氧缺血的關(guān)系 筆者的研究表明，PBLC中Clock mRNA和Bmal1 mRNA的含量水平在缺氧缺血后均發(fā)生了明顯變化，Clock mRNA和Bmal1 mRNA在HIE后表達(dá)降低。分析原因：（1）已經(jīng)證明，核心的生物鐘基因Clock和Bmal1的晝夜節(jié)律變化與機(jī)體的血糖水平是呈正相關(guān)的，缺血缺氧后組織細(xì)胞中的葡萄糖迅速消耗，血糖水平降低，Clock mRNA表達(dá)隨之減少[16]。（2）組織細(xì)胞發(fā)生缺氧后，NAD+依賴性酶SIRT1被激活，從而影響Clock、Bmal1的轉(zhuǎn)錄[17]。（3）缺血缺氧后SCN和松果體中褪黑素的合成和分泌受到影響。（4）鐘基因Clock、Bmal1作為核心基因，其蛋白產(chǎn)物CLOCK和BMAL1形成螺旋-環(huán)-螺旋（helix–loop–helix）的異二聚體CLOCK/BMAL1，其變化存在相同趨勢(shì)[18]。

綜上所述，缺氧缺血性腦病是多因素多機(jī)制共同作用下導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病，晝夜節(jié)律的紊亂亦參與其中，既是疾病導(dǎo)致的結(jié)果，也可能影響疾病的轉(zhuǎn)歸，而且晝夜節(jié)律的改變也可以反映機(jī)體的生理和病理狀態(tài)。對(duì)生物鐘系統(tǒng)的研究能夠?yàn)樯钊胙芯縃IE的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，進(jìn)一步闡述HIE的病理生理變化。同時(shí)筆者也希望在臨床上進(jìn)行調(diào)整恢復(fù)生物鐘系統(tǒng)，能夠更好地輔助治療缺氧缺血性腦病。

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The Changes of Biological Clock Genes’ Expression in PBLC of HIE Neonates/

LI Yong-fu，F(xiàn)ENG Xing.// Medical Innovation of China，2015，12（10）：011-014

Objective：To study the effect of circadian rhythm disorder induced by HIE in clock genes through the comparison changes of hypoxic ischemic encephalopathy full-term neonates and normal neonates in the peripheral blood lymphocytes cell （PBLC） in biological clock gene Clock mRNA， Bmal1 mRNA levels.Method：32 patients of HIE and 24 normal full-term newborns were determinated by semi quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR） in PBLC Clock mRNA， Bmal1 mRNA，the difference between groups were compared.Result：In groups HIE the levels of Clock mRNA and Bmal1 mRNA displayed significantly lower than the control groups， the difference was statistically significant（P＜0.05），the changes trend of Bmal1 mRNA and Clock mRNA in peripheral blood lymphocytes of HIE groups were basically in the same.Conclusion：The expression of Clock mRNA and Bmal1 mRNA were abnormalin PBLC of HIE group， which may plays a certain role in hypoxia and ischemia occurred after the disorder of circadian rhythm.

Brain hypoxia； Brain ischemia； Neonates； Peripheral blood lymphocytes cell； Clock gene

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.10.004

2015-01-12） （本文編輯：周亞杰）

江蘇省衛(wèi)生廳面上科研課題（H200519）

①江蘇省蘇州市立醫(yī)院本部 江蘇 蘇州 215002

②蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院

馮星

First-author’s address：Suzhou Municipal Hospital，Suzhou 215002，China