袁炳楠，董其飛，陳 成，郭明輝　(東北林業(yè)大學(xué)生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040)

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納米磁性載體在固定化漆酶技術(shù)中的應(yīng)用

袁炳楠，董其飛，陳 成，郭明輝*(東北林業(yè)大學(xué)生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040)

漆酶又稱苯二酚氧化酶。19世紀(jì)80年代日本學(xué)者田彥六郎首次在紫膠漆樹的樹液中發(fā)現(xiàn)一種能使樹漆氧化、硬化的酶。目前，已有超過20種不同來源的真菌漆酶可以實(shí)現(xiàn)提純。漆酶具有高效的低溫下催化性和底物專一性，皆為糖蛋白單體酶。酶分子中存在3個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)，一般都結(jié)合有4個(gè)銅離子。在進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，位于活性結(jié)合位點(diǎn)的銅離子從底物吸收電子，使底物氧化形成自由基，進(jìn)而依次發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)催化效果，而所吸收的電子會(huì)使漆酶分子上的氧被還原生成漆酶催化反應(yīng)的唯一產(chǎn)物——水。正是由于漆酶的反應(yīng)條件溫和，催化效率高，它受到廣泛關(guān)注。然而，與大多數(shù)酶一樣，其最適反應(yīng)條件具有局限性，易失活且生產(chǎn)成本高，因而漆酶的使用受到一定的限制。于是，在20世紀(jì)60年代初期，固定化酶技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

1固定化漆酶技術(shù)

所謂固定化酶技術(shù)，是指利用物理或化學(xué)等手段將游離的酶與適當(dāng)載體相結(jié)合，將其固定在一定的空間區(qū)域內(nèi)，并且保持活性，使酶的使用范圍更加廣闊的方法。固定化酶技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：①使酶的活性更不易受pH、溫度等外界因素的影響，最適范圍更廣；②使酶更容易從底物中分離出來，可以回收，并重復(fù)使用，大大增加酶的利用效率，降低使用成本；③反應(yīng)條件要求降低，使酶可以更適應(yīng)連續(xù)的、自動(dòng)化的工業(yè)生產(chǎn)；④實(shí)現(xiàn)更多種類的酶同時(shí)進(jìn)行酶促反應(yīng)。經(jīng)過50余年的發(fā)展，目前固定化酶技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥合成、工業(yè)發(fā)酵、細(xì)胞工程、環(huán)境保護(hù)、結(jié)構(gòu)研究和生物合成等諸多領(lǐng)域。其中，用于酶固定化處理的載體主要可以分為天然高分子載體、合成高分子載體、無機(jī)載體和復(fù)合載體四類。天然高分子載體主要有殼聚糖、甲殼素、瓊脂等，具有無毒、易結(jié)合、易分解、強(qiáng)度差等特點(diǎn)。合成高分子載體常見的有聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯醇，普遍具有機(jī)械強(qiáng)度大的特點(diǎn)。無機(jī)載體主要有SiO2、TiO2，具有穩(wěn)定性好、強(qiáng)度高、無毒、成本低、壽命長等諸多優(yōu)點(diǎn)。而復(fù)合載體則是將以上3種載體中的若干相結(jié)合，使其優(yōu)點(diǎn)兼具，如活性炭聚丙烯酸酯復(fù)合載體[1]。目前，最多的是將有機(jī)或無機(jī)載體與磁性微粒相結(jié)合，形成磁性復(fù)合載體，如磁性殼聚糖載體、磁性SiO2、介孔SiO2/Fe3O4載體[2]。

2納米磁性復(fù)合載體

納米磁性復(fù)合載體是隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展衍生而出的一種新型固定化酶載體，是指在傳統(tǒng)載體的基礎(chǔ)上加入磁性中心，并將載體的尺寸縮小至納米量級(jí)。納米磁性復(fù)合載體兼具單一類型載體的各種優(yōu)點(diǎn)，又可以利用外加磁場進(jìn)行快速分離、回收，使得納米級(jí)的磁性載體成為各相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

2.1介孔SiO2/Fe3O4磁性載體介孔SiO2/Fe3O4磁性載體以合成的納米Fe3O4為磁性核心，外面包覆SiO2形成核殼結(jié)構(gòu)，其中SiO2表面具有多孔結(jié)構(gòu)，其尺寸在介孔材料范圍。按照國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的定義，介孔材料的孔徑應(yīng)在2～50 nm，具有高比表面積，孔道規(guī)則、均勻、有序，因而具有諸多微觀特性。1992年Mobi公司的研究人員們首次運(yùn)用納米結(jié)構(gòu)粒子組裝技術(shù)制備出具有均勻孔道、孔徑可調(diào)的介孔二氧化硅(MCM-41)[3]。其孔徑及形貌單一可控，比表面積高可達(dá)1 000 m2/g，孔體積大。豐富、規(guī)則的多孔和孔表面的官能團(tuán)非常適合漆酶附著固定。目前，以中空的核殼結(jié)構(gòu)介孔性能最佳。張紅等[4]以正硅酸乙酯為硅源，以Fe3O4為核心，以甘油和水形成的濁液為溶劑，利用溶膠凝膠法制得粗載體，再在500 ℃下熱處理3 h以縮小孔徑合成介孔SiO2/Fe3O4磁性載體。利用物理吸附的方法，使得漆酶黏附在載體，得到的漆酶表面活性和操作穩(wěn)定性得到顯著提高。Xie等[5]以中空的Fe3O4為核心得到相似的結(jié)構(gòu)。而王苗苗[6]先以SiO2亞微球?yàn)楹诵?，表面包覆?FeOOH，然后利用NaOH溶液去除SiO2，得到中空的β-FeOOH微球，再利用TEOS在堿性條件下的水解，以CTAB為結(jié)構(gòu)模板對(duì)其進(jìn)行包覆，最終得到中空的介孔β-FeOOH/SiO2磁性微球，采取相似的方法得到介孔SiO2/β-FeOOH/SiO2磁性載體。結(jié)果表明，中空的磁性微球單位質(zhì)量下固定漆酶的量比傳統(tǒng)實(shí)心微球更大，其比表面積大，密度更低。顯然，介孔載體材料由于其規(guī)則、有序以及可控的孔隙，它具有其他載體所沒有的特性，但是也使得其制備過程更加復(fù)雜，需要更精細(xì)的控制，并且不適合大規(guī)模的自動(dòng)化工業(yè)生產(chǎn)。

2.2非介孔SiO2/Fe3O4磁性載體與介孔材料不同，非介孔SiO2/Fe3O4磁性載體是以無機(jī)材料SiO2將磁性中心(Fe3O4)完全包裹形成核殼結(jié)構(gòu)，按照不同的固定化方法對(duì)表面包裹的SiO2進(jìn)行化學(xué)修飾，使之可以與漆酶結(jié)合實(shí)現(xiàn)固定化處理。羅開昆[7]利用硅烷偶聯(lián)劑包埋法制備多型載體，研究了SiO2、巰基丙酸、巰基丙酸酰胺-乙酰等同包裹材料的固定效果，得出最佳材料。劉宇等[8]以加入檸檬酸三鈉和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的方法改進(jìn)了共沉淀法制備的 Fe3O4納米顆粒，使其分散性更佳；又通過其改良的溶膠-凝膠法制備出分散性較好的磁性 SiO2，以硅烷偶聯(lián)劑氨基化處理配合戊二醛固定化漆酶，得到較好的效果，并且研究最佳試驗(yàn)條件。該種方法利用化學(xué)鍵結(jié)合漆酶，結(jié)合強(qiáng)度大，是最穩(wěn)定的固定化方法。

2.3螯合銅離子的SiO2/ Fe3O4磁性載體螯合是由中心離子和滿足一定條件的多齒型配位體的兩個(gè)或兩個(gè)以上配位原子形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的配合物的作用過程。螯合物屬于配合物的一種，是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的配合物，具有明顯的熱力學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。賀芙蓉等[9]在堿性條件下的十二烷基磺酸鈉水溶液中采用共沉淀法制備了Fe3O4，在Fe3O4懸濁液中利用TEOS在堿性條件下水解的反應(yīng)使生成的SiO2直接包覆在Fe3O4表面，得到磁性載體。Cetinus等[10]以γ-氯丙級(jí)三甲氧基硅烷將表面的SiO2硅烷化，并與PAM反應(yīng)結(jié)合，最后加入CuSO4，制備表面螯合銅離子的SiO2/Fe3O4磁性載體。同時(shí)，研究了利用固定化后的漆酶對(duì)水中2，4-二氯酚的降解效果，得出最適pH和底物濃度以及Cu2+濃度對(duì)漆酶固定化效率的影響，得出0.2 mol/L的最佳濃度[11]。這種螯合銅離子的SiO2/ Fe3O4磁性載體是令漆酶以配位鍵的形式固定，熱穩(wěn)定性較好，而且克服采取交聯(lián)法和共價(jià)鍵結(jié)合法由于反應(yīng)條件較劇烈導(dǎo)致漆酶活性降低的缺陷，避免對(duì)漆酶天然高分子結(jié)構(gòu)的損傷，保持漆酶的活性和高催化性。螯合物本身又具有一定磁效應(yīng)[12]，提高漆酶使用后的磁性分離效果。

2.4殼聚糖+ Fe3O4磁性載體殼聚糖是一種自然界廣泛存在的天然高分子，具有生物安全性、強(qiáng)吸附性、生物降解性和抑菌性等多種優(yōu)秀特性，在酶的固定化領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。早在1996年，錢國強(qiáng)等[13]以殼聚糖微球固定L-天門冬酰胺酶，獲得較高的回收率。隨著各種磁性載體的相繼出現(xiàn)，殼聚糖磁性載體由于其具有天然、無毒、易降解等特點(diǎn)受到關(guān)注。有研究表明，以戊二醛為交聯(lián)劑，利用反向懸浮法制備具有良好的機(jī)械性能、穩(wěn)定耐熱、尤其是不受金屬離子干擾優(yōu)點(diǎn)的磁性殼聚糖微球，并將之用于漆酶的固定化處理，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和工業(yè)化生產(chǎn)。通過加入親水性單體——戊二醛，采用單體聚合法以戊二醛為交聯(lián)劑合成核殼結(jié)構(gòu)的殼聚糖磁性載體，利用其固定的漆酶在催化腎上腺素的試驗(yàn)中效果顯著。

2.5聚苯乙烯+ Fe3O4磁性載體合成高分子載體具有成本低、制備簡單快速、穩(wěn)定性好、耐酸堿、可以使用較苛刻的環(huán)境等諸多優(yōu)點(diǎn)。曹陽等[14]以聚苯乙烯和二氯甲烷為油相，以十二烷基苯磺酸鈉為表面活性劑，F(xiàn)e3O4處理，制備納米聚苯乙烯磁性載體，研究溫度、攪拌速度和pH等對(duì)磁性微球形貌、尺寸和磁學(xué)性能的影響，并且得出最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.6四氨基金屬鈦箐+ Fe3O4磁性載體酞菁(Pc)類化合物的分子具有較大的共扼體系。這使其具有較好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、耐燃燒性、耐酸堿性。由于金屬酞菁(MPc)中的金屬離子周圍的軌道存在空穴，可以與帶有孤對(duì)電子的原子或離子形成配位鍵。它所帶有的四氨基有利于酞菁類化合物通過氨基進(jìn)行次級(jí)化學(xué)反應(yīng)。Fe3O4納米粒子表面的O離子帶有孤對(duì)電子，并且處于活化狀態(tài)，因而在一定的條件下MTAPc可以和Fe3O4納米粒子以配位鍵復(fù)合，形成MTAPc/Fe3O4復(fù)合粒子，從而提高Fe3O4納米粒子的穩(wěn)定性能，防止其氧化，同時(shí)復(fù)合載體并不影響納米Fe3O4，仍具有超順磁性，又可以利用氨基與各種生物分子交聯(lián)。還有研究表明，以Cu為配位體金屬，制備四氨基Cu鈦菁包覆Fe3O4的磁性載體，并且利用其成功地固定漆酶。通過檢測，發(fā)現(xiàn)所制得的磁性載體性能優(yōu)異，在熱穩(wěn)定性、抗氧化性、溶解性和貯藏穩(wěn)定性等方面均較好。

3結(jié)語

漆酶作為一種天然生物酶，催化效率高，催化產(chǎn)物為完全無污染的水。它是一種非常環(huán)保的酶類，在降解污染物、生物科學(xué)、化學(xué)等諸多領(lǐng)域都有巨大的應(yīng)用價(jià)值。納米磁性載體固定化漆酶技術(shù)不僅使得漆酶可以適用于更加廣泛的物理?xiàng)l件，而且使得漆酶在使用后可以進(jìn)行快速分離，并且回收利用。這大大提高使用效率，降低使用成本。目前，各類型磁性復(fù)合載體的研究已較全面。未來的發(fā)展方向之一就是如何將磁性載體固定化漆酶這一工藝操作自動(dòng)化，如何批量地對(duì)漆酶進(jìn)行固定化處理，并且保證使用后的回收率足夠高，成本足夠低，使固定化的漆酶可以進(jìn)行工業(yè)化的生產(chǎn)和使用。

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摘要漆酶是一種具有高效催化效用的氧化酶。它的催化產(chǎn)物為水，完全不對(duì)環(huán)境產(chǎn)生任何污染，因而其利用受到各方研究人員越來越多的關(guān)注。近年來，隨著新型材料、環(huán)境保護(hù)等相關(guān)領(lǐng)域的高速發(fā)展，大量高質(zhì)量、高性能的材料在固定化漆酶方向得以應(yīng)用。納米磁性復(fù)合載體就是其中一種。它在回收循環(huán)利用、提高利用效率以及擴(kuò)大漆酶可使用條件方面的效果明顯。

關(guān)鍵詞固定化漆酶；磁性載體；應(yīng)用

Application of Magnetic Nanoparticle Composite Carriers in Immobilized Laccase

YUAN Bing-nan, DONG Qi-fei, CHEN Cheng, GUO Ming-hui*(Key Laboratory of Biomass Materials Science and Technology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

AbstractLaccase as a kind of oxidases, which has a high efficiency catalysis. And its catalysate is H2O that means laccase is absolutely without any polluted. So, more and more attentions have being paid on laccase because of this. In recent years, with the rapid development of the researches in materials, environment, and other related areas, growing numbers of new and high quality materials have been made into the carries of immobilized laccase. The magnetic nanoparticle composite immobilized the free-state laccase is a kind of the new materials, which has a good effect on improving its utilization factor, recycling and expanding usable conditions.

Key wordsImmobilized laccase; Magnetic carriers; Application

收稿日期2015-04-29

通訊作者

作者簡介袁炳楠(1992- )，男，黑龍江哈爾濱人，本科生，專業(yè)：木材科學(xué)。*，教授，博士生導(dǎo)師，從事生物質(zhì)復(fù)合材料方面的研究。

基金項(xiàng)目林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404506)；東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生院級(jí)創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(CL2014020)。

中圖分類號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)18-022-02