王東方

(濰坊學(xué)院山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室，山東濰坊261061)

細胞程序性死亡(Programed cell death，PCD)是動植物由自身基因調(diào)控的細胞自主、有序的死亡方式［1］。PCD不僅是一類特殊的細胞死亡方式，而且對動植物本身來說具有獨特的意義。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及生物技術(shù)的進步，細胞凋亡的有關(guān)研究不僅在動物和醫(yī)學(xué)中深入開展，而且PCD研究也在植物學(xué)中廣泛展開，成為植物學(xué)研究的熱門領(lǐng)域。有關(guān)研究表明，在眾多的環(huán)境脅迫如干旱、高低溫及鹽堿脅迫下合成半胱氨酸蛋白酶的mRNA會逐漸積累且增多［2－3］，在植物發(fā)生PCD的過程中半胱氨酸蛋白酶mRNA也會增加。這說明半胱氨酸蛋白酶(Caspase)與植物發(fā)生PCD有密切關(guān)系［4］。

1 Caspase的基本結(jié)構(gòu)和分類

半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase)是一類與生物細胞因子成熟和細胞凋亡有關(guān)的蛋白酶，是富含半胱氨酸的一類蛋白酶家族。它們的活性位點均含半胱氨酸殘基，能夠在特異天冬氨酸殘基肽鍵部位進行切割，造成細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族系列是細胞進行死亡機制的主要“調(diào)控者”。Caspase蛋白酶組被刺激激活后，啟動細胞死亡程序，導(dǎo)致細胞進入死亡調(diào)控的執(zhí)行階段［5］。Caspas是由兩個前體合成的，前體是由兩個亞單位組成的異二聚體，每個功能性Caspase都是由兩個前體的結(jié)合形成，然后形成異四聚體。Caspase的激活經(jīng)過兩次在天冬氨酸羥基端的肽鍵部位裂解，經(jīng)裂解后蛋白酶前體被切割成三部分，其中第一部分稱為抑制區(qū)域，即斷裂后的H2N-端，當(dāng)被切斷后丟失，另外兩部分是死亡區(qū)域，即COOH-端斷裂后分成大小兩個亞單位，斷裂的大小亞單位嵌合組成一個以p片層構(gòu)成的核心，d螺旋在其兩側(cè)，由兩大兩小亞單位進一步結(jié)合成活化酶。該四聚體在所對應(yīng)的兩端有兩個活性位點，可作用于其本身及其他Caspase酶原，依照一定次序依次激活Caspase，形成酶級聯(lián)反應(yīng)［6－7］。

Caspase家族包括許多種，多數(shù)與細胞程序凋亡有關(guān)，有些與炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)［8］。根據(jù)功能、位置，可將Caspase家族大致分為兩種類型:I型Caspase，又稱為啟動型Caspase(Initiator Caspase)，包括 Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等，存在于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的最上端，在輔助蛋白因子的輔助下進行活化并激活下端的Caspase;Ⅱ型Caspase，又稱為執(zhí)行型 Caspase(Executioner Caspase)，包括 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，其功能是特異性地使底物裂解，使細胞發(fā)生形態(tài)以及生理生化變化，致使細胞凋亡。此外，還有一類 Caspase(包括 Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-13、Caspase-14等)，主要功能是與細胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，同時在細胞程序性死亡過程中起輔助作用［9］。

2 Caspase參與植物PCD的過程

Caspase的研究最早開始于線蟲(C．elegans)細胞程序化死亡的相關(guān)研究。Caspase是動物程序死亡進行啟動及執(zhí)行階段的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物中雖然沒有分離得到Caspase基因，但是在植物細胞死亡過程中檢測到Caspase活性的提高。已有研究表明，植物細胞凋亡過程中Caspase活化，推測其分子結(jié)構(gòu)與動物不同，在PCD中執(zhí)行的功能也可能不同［10］。用動物Caspase活性分析試劑盒檢測湖北海棠根系，發(fā)現(xiàn)存在Caspase-3或Caspase-7活性［11］。在研究平邑甜茶及新疆野蘋果的細胞程序性死亡時，免疫印跡試驗表明在干旱脅迫條件下兩種砧木葉中都含有類Caspase-3蛋白酶，而根中不存在，通過Western bolt檢測出類Caspase-3的分子量約40 kD，比動物高8 kD左右［12］。

2．1 植物Caspase的種類 基因序列分析研究證明，在擬南芥基因組中沒有檢測到編碼Caspase酶類的基因，但是在正在死亡的植物細胞中可以檢測到Caspase活性的升高，表明植物細胞程序性死亡進程并非是Caspase，而是與Caspase有類似酶活性的其他類型的蛋白酶有關(guān)?；蚪M序列比對證明，在植物的某些序列編碼的蛋白酶中與Caspase在空間結(jié)構(gòu)上具有一定的相類似的特性，并且可被Caspase酶類抑制劑抑制其活性。煙草原生質(zhì)體用menadione誘導(dǎo)細胞程序性死亡的研究表明，抑制劑Ac-DEVD-CHO和Ac-YVADCHO能抑制Caspase活性，阻止DNA的斷裂和PARP(poly-(ADP-ribose)polymerase)的降解［13］。目前，植物中已鑒定出的半胱氨酸蛋白酶可以分為三類，其中豆類中天冬氨酸蛋白酶(1egumain)家族的液泡加工酶(vacuolar processing enzymes，VPEs)和metacaspase屬于半胱氨酸內(nèi)肽酶，與Caspase具有類似的氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)，是Caspase的同系物;絲氨酸內(nèi)肽酶(saspases)是枯草芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶，能分解人工合成的Caspase底物。最新的研究表明，saspases、VPEs、metacaspase在植物細胞程序性死亡過程中均起類似Caspase酶類的重要調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)、控制與執(zhí)行植物細胞程序性死亡。

2．2 動植物Caspase的異同 植物半胱氨酸蛋白酶與動物細胞凋亡過程中Caspase蛋白酶類似，也介入植物細胞程序性死亡的調(diào)控過程及環(huán)節(jié)。Poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)參與H2O2誘導(dǎo)的植物PCD，而植物PARP的降解依賴于細胞色素C釋放到胞質(zhì)中，可被特異地Caspase-3抑制劑所抑制［14］。

動物和植物細胞中的半胱氨酸蛋白酶的區(qū)別主要有以下兩點。①存在部位不同。植物Caspase存在于細胞壁和液泡，而且葉綠體中的半胱氨酸蛋白酶可以降解糖1，5-二磷酸核酮羧化酶(Rubisco)，而有酶活性的動物Caspase蛋白只存在于細胞質(zhì)中，液泡中不存在。②同源性較低。研究表明，植物細胞中的半胱氨酸蛋白酶包括基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能同源性均比較低，而動物Caspase蛋白家族相比就高得多。所以，相關(guān)學(xué)者對植物中是否真正存在由半胱氨酸蛋酶參與的PCD調(diào)控機制還持有不同觀點。

2．3 植物Caspase及其編碼基因 雖然半胱氨酸蛋白酶家族被外界有關(guān)信號激活機制以及參與調(diào)控細胞死亡的具體調(diào)控進程還不明確，但關(guān)于Caspase的研究，已經(jīng)從許多植物中成功地得到其編碼基因。根據(jù)植物半胱氨酸蛋白酶的基因表達特點，可將其分為以下三類。

一是存在于植物正常發(fā)育階段中或存在植物某些特殊時期所表達的半胱氨酸蛋白酶。Carne等［15］從中華獼猴桃(Actinidia chinensis)中獲得一種半胱氨酸蛋白酶，測定其氨基酸序列，即actinidain。Ryan等［16］在研究杏樹果實成熟時發(fā)現(xiàn)一個編碼半胱氨酸蛋白酶基因的高度表達，成功提取其mRNA。這為今后的研究提供基礎(chǔ)。Lee等［17］試驗獲得水稻半胱氨酸蛋白酶基因OsCP1，發(fā)現(xiàn)OsCP1基因在水稻未成熟的花藥中表達，通過T-DNA插入突變體分析表明Caspase基因OsCP1主要參與水稻花粉的生長發(fā)育過程。嚴(yán)秀蕊等［18］在水稻發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)Caspase酶相關(guān)基因OsCP2，結(jié)果表明它也在水稻未成熟的花藥中及花藥絨氈層，且只在花粉發(fā)育的空泡花粉時期到成熟時期進行表達。張紅巖等［19］采用SSH(Suppression subtractive hybridization)和Race-PCR(Rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)克隆得到來自油菜(Brassica napus L．)矮化突變體‘NDF-1’的一個半胱氨酸蛋白酶相關(guān)基因Bncp5;RT-PCR檢測表明，該基因具有植物組織中表達特異性。Tripathi等［20］在玫瑰花瓣脫落過程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活一個37 kD的伴隨乙烯反應(yīng)的半胱氨酸蛋白酶基因Rb-CP1。該基因與蛋白質(zhì)的降解過程密切相關(guān)。張國林等［21］在花生果種皮中發(fā)現(xiàn)一個半胱氨酸蛋白酶基因AhPSG13。RT-PCR檢測表明，該基因在果種皮中表達特異性。

二是在生物脅迫和非生物脅迫條件下產(chǎn)生的半胱氨酸蛋白酶。在對擬南芥的逆境研究中，發(fā)現(xiàn)RD(Responsive to dehydration)系列基因包括 rd19A、rd21A以及 rd29A/cor78/lit78［22］。RD系列基因已成為植物逆境研究中的關(guān)鍵點，對于逆境信號傳導(dǎo)通道的交叉研究具有重要意義。Rossano等［23］發(fā)現(xiàn)在水分脅迫下，利用RACE方法得到小麥Caspase基因TaCP(AY841792)。朱家紅［24］在橡膠樹樹膠乳中克隆獲得一個半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1;半定量RT-PCR結(jié)果顯示，通過乙烯傷害誘導(dǎo)膠乳HbCP1基因的表達，推測膠乳中的HbCP1蛋白可能具有防御功能。曹慧等［25］在研究蘋果砧木八棱海棠中也分離得到了Caspase基因。

三是在衰老的植物組織中Caspase表達量增加或在衰老時期半胱氨酸蛋白酶特異性表達。衰老是指生物體在進行生命活動、生理代謝過程中，隨著時間的增加，生物體細胞增殖分化能力、生理功能等逐漸發(fā)生衰退的變化過程。衰老是生物內(nèi)在因子調(diào)控的結(jié)果，最終導(dǎo)致細胞逐漸死亡，有時將衰老視為程序化死亡過程［26］。在各種衰老的植物組織中分離獲得許多調(diào)控半胱氨酸蛋白酶的基因，都被稱作衰老相關(guān)基因SAG(Senescence associated genes)，如擬南芥的SAG2和SAG12，玉米的 See1 和 See2，油菜的 LSC7 和 LSC790［27］，番茄的Cyp23和煙草的NTCP223［28］。這些基因在衰老的葉片中均過量存在。王勇等［29］在大豆葉片衰老過程中發(fā)現(xiàn)了一個半胱氨酸蛋白酶相關(guān)基因，它在衰老的葉片中特異性表達。沈法富等［30］從棉花衰老葉片中克隆了編碼半胱氨酸蛋白酶的cDNA，被稱為Ghcysp(AY604196)。研究表明，該基因在棉花的花中、根部、下胚軸及幼葉等生長旺盛部位中不表達，而在棉花的衰老葉片中特異性表達。King等［31］研究表明，在花椰菜花瓣衰老過程中半胱氨酸蛋白酶顯著表達。朱海生等［32］在草莓中克隆取得半胱氨酸蛋白酶基因FaCP，并且發(fā)現(xiàn)FaCP基因表達量隨著衰老程度的增加而逐漸增加，尤其是在衰老后期顯著上升。

3 結(jié)語

半胱氨酸蛋白酶家族介入了植物生長和發(fā)育過程中蛋白的降解，在種子萌發(fā)、果實發(fā)育及成熟、器官衰老與脫落等生理活動進程中起重要作用;介入響應(yīng)外界病菌侵入時的超敏反應(yīng);也與植物木質(zhì)部分化有關(guān)，并和器官衰老引發(fā)的PCD相關(guān)聯(lián)。半胱氨酸蛋白酶系列基因不但參與植物的衰老調(diào)控，而且參與信號傳導(dǎo)，并響應(yīng)外界環(huán)境中的生物和非生物脅迫［14，33］，但在植物對外界非生物脅迫和生物脅迫的響應(yīng)以及器官分化和衰老的過程中，Caspase的功能、作用研究才剛開始。與動物Caspase的研究相比，在植物中的有關(guān)功能機理還需要進一步研究。有關(guān)植物細胞程序性死亡Caspase類蛋白酶的研究尚處于起始階段。隨著細胞凋亡研究的不斷深入，植物細胞Caspase功能與程序性死亡關(guān)系的研究將會進入一個新階段，從而進一步揭示植物細胞程序性死亡中Caspase酶類作用機理和機制。

［1］KEER J F，WYLLIE A H，CARRIE A R．Apoptosis:A basic biolclgical phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics［J］．Br J Cancer，1972，26(4):239 －245．

［2］JENNIFER T J，JOHN E M．A salt-and dehydration-inducible pea gene，Cyp15a，encodes a cell-wall protein with sequence similarity to cysteine protease［J］．Plant Molecular Biology，1995，28(6):1055 －1065．

［3］MASAHIRO K，KAZUKO Y，HIDEO T，et al．Structure and expression of two genes that encode distinct drought-inducible cysteineproteinases in Arabidopsis thaliana［J］．Gene，1993，129(2):175 －182．

［4］TADAMASA U，SHIGEMI S，YUKO O，et al．Circadian and senescence-enhanced expression of a tobacco cysteineprotease gene［J］．Plant Molecular Biology，2000，44(5):649 －657．

［5］SHI Y．Mechanism of caspase activation and inhibition during apoptosis［J］．Mol Cell，2002，9(3):459 －470．

［6］HOWARD Y，CHANG H Y，YANG X．Proteases for cell suicide:functions and regulation of Caspases［J］．Microbiol Mol Biol Rev，2000，64(4):821－846．

［7］NICHOLSON D W．Caspase structure，proteolytic substrates，and function during apoptotic cell death［J］．Cell Death Differ，1999，6(11):1028 －1042．

［8］THORNBERRY N A，LAZEBNIK Y．Caspases:enemies within［J］．Science，1998，281(5381):1312 －1316．

［9］TSCHOPP J，MARTINON F，BURNSK．NALPs:A novel protein family involved in inflmmation［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(2):95 －104．

［10］馬懷宇，肖靜，楊洪強．水分脅迫下湖北海棠根系線粒體及細胞死亡特性研究［J］．園藝學(xué)報，2007，34(3):549 －554．

［11］譚冬梅．干旱脅迫誘導(dǎo)新疆野蘋果和平邑甜茶細胞程序性死亡的研究［D］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005:28 －32．

［12］李嘉琦，吳娟．Caspases與細胞凋亡［J］．動物醫(yī)學(xué)進展，2003，24(1):53－55．

［13］SUN Y L，ZHAOY，HONGX，et al．Cytochrome c release and caspase activation during menadione-induced apoptosis in plants［J］．FEBS Lett，1999，462(3):317 －321，

［14］GRUDKOWSKA M，ZAGDANSKA B．Multifunctional role of plant cysteine proteinases［J］．Acta Biochemical Polonica，2004，51(3):609 －624．

［15］CARNE A，MOORE CH．The amino acid sequence of the tryptic peptide from actinidin，a proteolytic enzyme from the fruit of Actinidia chinesis［J］．Biochemical Journal，1978，173(1):73 －83．

［16］RYANSN，LAINGW A，MCMANUSM T．A cysteine proteinase inhibitor purified from apple fruit［J］．Phytochemistry，1998，49(4):957 －963．

［17］LEE S，JUNG K H，AN G，et al．Isolation and characterization of a rice cysteine protease gene，OsCP1，using T-DNA gene-trap system［J］．Plant Mol Biol，2004，54(5):755 －765．

［18］嚴(yán)秀蕊，張大生，梁婉琪，等．水稻半胱氨酸蛋白酶OsCP2的特征分析及其原核表達與純化［J］．上海交通大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2010，28(2):140－146．

［19］張紅巖，薛華，馬欣榮，等．甘藍型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆及組織特異性表達分析［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2008，14(2):172－176．

［20］TRIPATHI SK，SINGH A P，SANE A P，et al．Transcriptional activation of a37 kDa ethylene responsive cysteine protease gene，RbCP1，is associated with protein degradation during petal abscission in rose［J］．J Exp Bot，2009，60(7):2035 －2044．

［21］張國林，石新國，蔡寧波，等．花生果種皮特異表達基因AhPSG13的克隆和表達研究［J］．中國油料作物學(xué)報，2010，32(1):35 －40．

［22］BEERSE P，JONESA M，DICKERMAN A W，The S8 serine，C1A cysteine and A1 aspartic protease families in Arabidopsis［J］．Phytochemistry，2004，65(1):43 －58．

［23］ROSSANO R，LAROCCA M，RICCIO P．2-D zymographic analysis of Broccoli(Brassica oleracea L，var，Italica)florets proteases:Follow up of cysteine protease isotypes in the course of post-harvest senescence［J］．Jourmal of Plant Physiology，2011，168(13):1517 －1523．

［24］朱家紅．巴西橡膠樹半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1的克隆與表達分析［D］．儋州:華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007:66．

［25］曹慧，程姣姣，劉春香，等．干旱脅迫下八棱海棠PCD特征檢測及類Caspase基因片段的克隆與分析［J］．果樹學(xué)報，2012，29(4):525－529．

［26］NOODEN L D，GUIAMET JJ．Genetic control of senescence and aging in plants［M］//SCHNEIDER E L，ROWE JW．Handbook of the biology of aging．4th ed．Orland:Academic Press，1996:94 －118．

［27］沈成國，關(guān)軍鋒，王曉云，等．植物衰老生理與分子生物學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001:355－359．

［28］ADAMSJM，CORRY S．The Bcl-2 protein family:Arbitersof cell survival［J］．Science，1998，9(2):1322 －1326．

［29］王勇，夏建潤，王寧寧，等．與大豆葉片衰老相關(guān)的cDNA的克?。跩］．南開大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1999，32(3):182 －188．

［30］沈法富，喻樹迅，韓秀蘭，等．棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和表達特性分析［J］．科學(xué)通報，2004，49(22):2318 －2323．

［31］KINGK L，GIDLOWSKI JA．Cell cycle regulation and apoptosis［J］．Annu Rev Physiol，1998，60(9):601 －617．

［32］朱海生，陳敏氡，溫慶放，等．草莓半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及表達分析［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013，21(2):158 －164．

［33］CHEN H J，SU C T，LIN C H，et al．Expression of sweet potato cysteine protease SPCP2 altered developmental characteristics and stress responses in transgenic Arabidopsis plants［J］．Journal of Plant Physiology，2010，167(10):838－847．