趙琪，臧曉韻，胡海峰

1(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200040)

2(上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海，201106)

馬黛茶，又名巴拉圭茶(Ilex paraguariensis)，屬冬青科冬青屬，原產(chǎn)于南美，由南美洲獨(dú)有的馬黛樹葉精制而成，與咖啡、茶(紅茶和綠茶)并稱“世界三大茶”［1-2］。其具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌、保護(hù)心腦血管、減肥、消炎和免疫調(diào)節(jié)等活性［3］，受到了許多國(guó)家的關(guān)注，我國(guó)也于2004年將馬黛茶凈油或提取物列入食品用香料名單［4］。其中，多酚是巴拉圭茶的主要活性成分［5-7］，主要是綠原酸類物質(zhì)包括綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C，以及少量的槲皮素、蘆丁、山奈酚等黃酮類物質(zhì)［8-9］，而非中國(guó)傳統(tǒng)茶葉所含的兒茶素類物質(zhì)。目前，關(guān)于馬黛茶多酚的分析檢測(cè)方法主要有比色法、TLC、HPLC、HPLC-ESI/MS 等方法［4，9-11］。

加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)是一種新興的微分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分析手段相比，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、試劑和樣品消耗少等突出優(yōu)點(diǎn)［12］，近幾年開始也用于中藥活性成分分析［13］，并顯現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。而目前采用pCEC對(duì)馬黛茶多酚的分析及定量研究國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究建立了應(yīng)用pCEC定量分析馬黛茶中4種多酚類化合物的新方法，以期建立一種高效、低耗、準(zhǔn)確的馬黛茶多酚的分析方法，從而完善了馬黛茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜儀(上海通微分析技術(shù)有限公司)，包括2臺(tái)高壓輸液模塊，微流控模塊，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(190～800 nm)，高壓電源模塊(±30 kV);KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);實(shí)驗(yàn)pH計(jì)(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司);Waters 515高效液相色譜。

新綠原酸(1，批號(hào) 130629)、綠原酸(2，批號(hào)131101)、異綠原酸 A(3，批號(hào)130919)、異綠原酸C(4，批號(hào)130920)的對(duì)照品，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，純度≥98%;馬黛茶A(巴西原裝伯隆馬黛茶，1 000g)、馬黛茶B(伯隆馬黛茶焦香型，2g/袋)、馬黛茶C(伯隆經(jīng)典原味袋泡茶，2g/袋)，上海伯隆食品有限公司;乙腈(色譜純)，上海人民化工廠;水為娃哈哈純凈水;H3PO4、氨水(分析純)，上海試劑一廠;其他試劑均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

供試樣品的制備［4］:將馬黛茶A低溫干燥后，粉碎成粗粉(過60目篩)，稱取干燥的馬黛茶A粉末1.000g，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，80℃下加熱回流90 min，抽濾，用70%乙醇定容于50 mL容量瓶，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

對(duì)照品的制備:分別精密稱取1～4對(duì)照品各6.0、4.0、6.0、14.0 mg，加入流動(dòng)相定容于5 mL 容量瓶中制成對(duì)照品貯備液。使用時(shí)根據(jù)需要用流動(dòng)相稀釋至相應(yīng)的濃度。

1.2.2 色譜條件

1.2.2.1 pCEC色譜條件

毛細(xì)管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑100μm，毛細(xì)管全長(zhǎng) 45 cm，有效長(zhǎng)度 20 cm，ODS填料粒徑3 μm)購于蘇州環(huán)球色譜責(zé)任有限公司;流動(dòng)相A:10%甲醇+磷酸(pH 2.5，2 mmol/L);流動(dòng)相B:乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng):325 nm;泵總流速:0.07 mL/min;電壓:-10 kV。其梯度洗脫程序見表1。

表1 pCEC梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program of pCEC

1.2.2.2 HPLC 色譜條件［4］

色譜柱 phenomenexC18(5μm，250mm ×4.6mm);流動(dòng)相A:10%乙腈+0.1%磷酸;流動(dòng)相B:乙腈。其梯度洗脫程序見表2。

表2 HPLC梯度洗脫程序Table 2 The gradient elution program of HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

由于多酚類化合物的酚羥基、羧基在水溶液中容易發(fā)生電離，極性增強(qiáng)，在固定相表面形成雙重保留，色譜峰發(fā)生拖尾，加入少量的酸性調(diào)節(jié)劑可以抑制多酚電離，減弱其在色譜柱的保留行為，從而改善峰形［14］，故實(shí)驗(yàn)選取甲酸、乙酸和磷酸3種常見的酸性調(diào)節(jié)劑考察。(圖1)

圖1 馬黛茶多酚的pCEC條件優(yōu)化圖譜Fig.1 The optimized chromatogram of Mate tea polyphenols by pCEC

結(jié)果表明，甲酸或乙酸作為改性劑時(shí)，各峰的峰 形不好，且分辨率較低;改用磷酸作為酸改性劑調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH時(shí)，峰形、分辨率、靈敏度都獲得較大的改善，故選擇磷酸作為酸改性劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)還調(diào)節(jié)了酸性調(diào)節(jié)劑的pH(2.5～5.5)和離子強(qiáng)度(2～16mmol/L)，結(jié)果如圖1所示。綜合考慮分離度和分離時(shí)間，最終選擇乙腈和磷酸(pH=2.5，2mmol/L)作為流動(dòng)相。

2.1.2 分離電壓的選擇

在加壓毛細(xì)管電色譜中，適當(dāng)?shù)母唠妷耗軌蛟黾与姖B流速度進(jìn)而縮短帶電物質(zhì)保留時(shí)間，從而縮短分析時(shí)間。實(shí)驗(yàn)考察-7、-10、-13、-16 kV電壓對(duì)分離的影響。結(jié)果表明，隨著分離電壓的增大，分析時(shí)間縮短。但是當(dāng)分離電壓高于-10 kV時(shí)，峰分離度變差。因此，選用分離電壓為-10 kV為最優(yōu)電壓。

2.1.3 最優(yōu)色譜條件

具體色譜條件同1.2.2.1，色譜圖結(jié)果見圖2。

2.1.4 線性范圍與檢出限和定量限

分別量取對(duì)照品溶液 2、1、0.5、0.25、0.125 mL，各置2 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容搖勻，得一系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按最優(yōu)pCEC色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到4種馬黛茶多酚的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限如表3所示。

圖2 馬黛茶提取物(A)及對(duì)照品(B)的pCEC圖譜Fig.2 pCEC chromatograms of Mate Teaextact and standard substance

表3 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Linear regression data，LOD(S/N≥3)and LOQ(S/N≥10)of the investigated compounds

2.1.4 精密度

取對(duì)照品貯備液125 μL，定容于1 mL容量瓶。重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，得到1～4的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.10%、2.12%、2.98%和2.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性

取供試品同一批的供試品溶液6份，在最優(yōu)條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，得到1～4的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.10%、2.12%、2.98%、2.20%，表明其重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性

取供試品，分別于 0、4、8、12、16 和 19 h 進(jìn)樣測(cè)定，考察其穩(wěn)定性，得到1～4的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.95% 、2.02% 、4.85% 、2.32% 。

2.1.7 回收率

向已知多酚含量的馬黛茶中定量添加對(duì)照品的混合溶液，按照1.2.1方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。4種馬黛茶多酚的回收率如表4所示。

2.2 樣品測(cè)定

各馬黛茶葉樣品按1.2.1方法平行制備3份樣品溶液，在1.2.2色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，3種馬黛茶產(chǎn)品中的多酚含量存在顯著差異:就不同產(chǎn)品品種而言，馬黛茶3的多酚含量最高，馬黛茶2的最低;就不同多酚物質(zhì)而言，綠原酸含量最低，其他組分的比例(除異綠原酸A)大致相當(dāng)。這些差異可能與馬黛茶在采收時(shí)間、加工過程的等方面存在一定的差別所致。

表4 馬黛茶中4種多酚物質(zhì)的回收率(n=3)Table 4 Recoveries for the assay of 4 components in Mate tea

表5 不同馬黛茶產(chǎn)品馬黛茶多酚含量差異mg/gTable 5 Difference of phenolic compounds in diffevent Mate tea mg/g

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立加壓毛細(xì)管電色譜技術(shù)(pCEC)同時(shí)測(cè)定馬黛茶中的新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的方法。通過優(yōu)化pCEC的色譜條件，獲得最佳的分析條件，并通過方法學(xué)驗(yàn)證證明其適合于馬黛茶多酚的定量測(cè)定。與常規(guī)的HPLC法相比，實(shí)驗(yàn)中所用有機(jī)試劑、樣品用量均遠(yuǎn)低于普通HPLC檢測(cè)用量，對(duì)于馬黛茶多酚的質(zhì)量控制及其大批量檢測(cè)具有較大的可行性，可以發(fā)展成為替代常規(guī)HPLC的分析方法，從而為馬黛茶在中國(guó)市場(chǎng)的流通提供強(qiáng)有力的質(zhì)量評(píng)價(jià)保證，發(fā)揮馬黛茶的保健功效。

［1］ Márquez V，Martínez N，Guerra M，etal.Characterization of aroma-impact compounds in yerba mate(Ilex paraguariensis)using GC –olfactometry and GC –MS［J］.Food Research International，2013，53(2):808-815.

［2］ 吳俊玲，高紅莉，劉昭純.馬黛茶及有效成分研究概況［J］.山東中醫(yī)雜志，2010(9):650-652.

［3］ 于少泓，吳俊玲，劉昭純.馬黛茶臨床作用研究進(jìn)展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010(4):370-372.

［4］ 熊建華.巴拉圭茶多酚的分離純化及功能研究［D］.長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［5］ Heck C I，De Mejia E G.Yerba Mate Tea(Ilex paraguariensis):urnal of Food Science，2007，72(9):R138-R151.

［6］ Chandra S，Gonzalez de Mejia E.Polyphenoliccompounds，antioxidantcapacity，andquinoneredu-ctase activity of an aqueous extract of Ardisiacompressa in comparison to mate(Ilex paraguarie-nsis)and green(Camellia sinensis)teas［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(11):3 583-3 589.

［7］ 高紅莉，曲曉蘭，劉昭純.馬黛茶多酚對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中藥藥理與臨床，2013，29(1):75-77

［8］ Bastos D H，Saldanha L A，Catharino R R，et al.Phenolic antioxidants identified by ESI-MS from yerba mate(Ilex paraguariensis)and green tea(Cameliasinensis)extracts［J］.Molecules，2007，12(3):423-432

［9］ Peres R G，Tonin F G，Tavares M F M，et al.HPLCDAD-ESI/MS identification and quantifi-cation of phenolic compounds in iiex paraguariensis beverages and on-line evaluation of indiv-idual antioxidant activity［J］.Molecules，2013，18(4):3 859-3 871.

［10］ Turkmen N，Sari F，Velioglu Y S.Effects of extraction solvents on concentration and antioxid-ant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin – Ciocalteumethods［J］.Food Chemistry，2006，99(4):835-841.

［12］ LU L，CHEN Y，YU X，et al.Pressurized CEC with am-perometric detection using mixed-mode monolithic column for rapid analysis of chlorophenolsand phenol［J］.Electrophoresis，2013，34:2 049-2 057.

［13］ 羅朵生，郭姣，周修騰.毛細(xì)管電色譜法在藥物分析中的應(yīng)用［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)報(bào)，2013，15(3):89-91

［14］ 胡華，張惟廣，肖昭競(jìng)，等.HPLC測(cè)定醬油中的8種酚酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(8):122-125.