李培培，陳敏，王軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

葡萄酒中富含多種營養(yǎng)及保健成分，具有延緩衰老、美容養(yǎng)顏和預(yù)防心腦血管疾病等多種功效，隨著人們對健康、高水平生活的重視和追求，葡萄酒的需求量越來越大。然而葡萄在種植過程中容易感染病害，防治病害的常用農(nóng)藥主要有苯并咪唑類和酰胺類等［1］，不恰當(dāng)?shù)氖褂棉r(nóng)藥，容易造成葡萄產(chǎn)品中這類農(nóng)藥超標(biāo)。

農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法主要有液液萃取法［2-3］、固相萃取小柱法［4-10］等，液液萃取法需要使用多種溶劑反復(fù)萃取才能達(dá)到樣品分析要求，操作復(fù)雜、費時、溶劑用量大。固相萃取小柱法則操作較復(fù)雜，需要配套裝置，成本較高。QuEChERS前處理方法使用乙腈提取后加入凈化劑凈化即可，所用試劑鹽包廉價易得，操作簡便、所需溶劑少、提取效率高。樣品前處理后常用的分析農(nóng)藥殘留的儀器有色譜［7-10］，氣質(zhì)聯(lián)用［11-12］和液質(zhì)聯(lián)用等［13-16］。已有文獻(xiàn)報道使用QuEChERS前處理方法同時檢測多種農(nóng)藥殘留［17-19］，柳菡［20］的報道中表明，用此方法可以同時檢測多菌靈和甲霜靈殘留，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法具有良好的選擇性和靈敏度，但這類儀器昂貴，使用成本高，應(yīng)用受到一定限制。色譜儀應(yīng)用較普遍，操作簡便且成本低，本文選用防止葡萄病害的多菌靈和甲霜靈分別作為苯并咪唑類和酰胺類農(nóng)藥的典型代表，通過優(yōu)化條件，建立QuEChERS前處理方法，再采用高效液相色譜(HPLC)分析方法，為檢測紅葡萄酒中不同種類的農(nóng)藥殘留提供了一種簡單有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多菌靈(純度99.5%)，美國Sigma-Aldrich公司;甲霜靈(純度99.5%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、甲醇(色譜純)，北京百靈威科技有限公司;C18、PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)填料(40 ～60 μm)，天津博納艾杰爾有限公司;無水MgSO4、NaCl、無水乙酸鈉(NaAc)、水合檸檬酸氫二鈉(Na2HCit·1.5H2O)、二水檸檬酸三鈉(Na3Cit·2H2O)、乙酸銨(CH3COONH4)，皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀，配有低壓四元泵、手動進(jìn)樣器、柱溫箱、G1315C二極管陣列檢測器，美國Agilent公司;QL-861旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;飛鴿TDL-5-A離心機，上海安科公司;Milli-Q超純水機，美國Millipore公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取多菌靈和甲霜靈10.0 mg(精確到0.1 mg)，用甲醇溶解并定容至100.0 mL，配置成單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)母液，于 -20℃貯存?zhèn)溆?。分別取20，50，100，200，500 μL 2 種單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)母液用甲醇稀釋，配置成 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

量取紅葡萄酒10.0 mL于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10.0 mL乙腈，渦旋1 min，加入4 g無水 MgSO4、1 g NaCl、1 g 無水 NaAc，迅速振蕩溶解鈉鹽后渦旋1 min，以3 000 r/min離心5 min。取靜置后的上清液2 mL置于5 mL離心管中，5 mL離心管中事先裝入300 mg無水MgSO4和100 mg PSA，渦旋1 min，在3 000 r/min下離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜后待測定。

1.5 色譜條件

色譜柱:Phenomenex HYPERSIL ODS-C18(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流動相:充分利用四元泵，準(zhǔn)備三個流動相，A:超純水、B:乙腈、C:50 mmol/L的乙酸銨水溶液，其中 VA∶VB∶VC=45∶45∶10 用于多菌靈的檢測，VA∶VB=50∶50用于甲霜靈的檢測。流速:1 mL/min;檢測波長:286 nm(多菌靈)和194 nm(甲霜靈);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS的優(yōu)化

雖然QuEChERS各個方法所用試劑及用量之間存在差異，但其原理相同，即首先加入乙腈，通過渦旋使水相與乙腈充分接觸，以達(dá)到農(nóng)藥充分轉(zhuǎn)移的目的，，然后加入無水MgSO4和提取鹽，其中無水Mg-SO4起到吸水作用，提取鹽是為了提高離子強度或創(chuàng)造合適的萃取環(huán)境。之后加入PSA、C18或GCB(石墨化碳黑)等吸附劑除去干擾物起到凈化作用。

2.1.1 吸附凈化劑的選擇

QuEChERS的吸附凈化劑主要有3種，分別是C18，PSA，GCB，其主要作用見表 1。

表1 主要的凈化劑及其作用Table 1 main purification reagents and their function

紅葡萄酒的主要成分有水、乙醇、有機酸、糖類、酚類物質(zhì)和芳香物質(zhì)。從表2可以看出，GCB強烈吸附非極性干擾物，對非極性的農(nóng)藥也會有吸附，多菌靈屬于非極性農(nóng)藥。根據(jù)紅葡萄酒的成分和3種吸附凈化劑的作用以及農(nóng)藥的性質(zhì)，初步選定C18和PSA作為吸附劑。

以加標(biāo)0.5 mg/L多菌靈和1.0 mg/L甲霜靈的紅葡萄酒為樣品，分別采用PSA+C18(a組)和PSA(b組)為吸附劑，其他實驗條件相同作對比，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同凈化劑對2種農(nóng)藥回收率的影響Fig.1 Effect of different purification reagents on the recovery of two pesticides

從圖1可以看出，對于多菌靈來說，a組的回收率明顯低于b組，這是因為多菌靈是非極性農(nóng)藥，而C18對非極性物質(zhì)有較好的吸附作用;對于甲霜靈a和b兩組的差異不大，因此只選擇PSA作為吸附凈化劑。

2.1.2 提取鹽的選擇

QuEChERS提取鹽主要有 NaCl、無水 NaAc、Na2HCit·1.5H2O和Na3Cit·2H2O。其中NaCl的作用是溶于樣品水溶液中提高離子強度，使水與乙腈充分分離;無水NaAc緩沖鹽可以使萃取環(huán)境處于一個弱堿性環(huán)境，Na2HCit·1.5H2O和Na3Cit·2H2O緩沖鹽組合使用可以使萃取環(huán)境的pH保持在5.5左右，保護(hù)在這個pH范圍穩(wěn)定的目標(biāo)化合物［21］。

以加標(biāo)0.5 mg/L多菌靈和1.0 mg/L甲霜靈的紅葡萄酒為樣品，分別采用NaCl(A組)、NaCl+NaAc(B 組)和 NaCl+Na3Cit·2H2O+Na2HCit·1.5H2O(C組)為提取鹽，其他實驗條件相同做對比，實驗結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，對于多菌靈來說，A組的回收率低于B和C組，這可能是由于多菌靈在較高的pH條件下(5.5以上)容易轉(zhuǎn)移到有機溶劑中［4］，A組只加入NaCl，萃取環(huán)境pH是紅葡萄酒自身的pH，通過實驗驗證在2.7～3.8之間。而后兩組的回收率相差不大;對于甲霜靈來說，B組回收率比A、C組稍高，綜合考慮，選擇NaCl+NaAc為提取鹽。

圖2 不同提取鹽對2種農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction salts on the recovery of two pesticides

2.2 線性范圍和檢出限、定量限

用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)母液，配制成 0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行HPLC分析，多菌靈和甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜圖如圖3。分別以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，多菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=39.280x-0.359，相關(guān)系數(shù)為r=0.999 95;甲霜靈的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=90.011x+1.204，相關(guān)系數(shù)r=0.999 53，多菌靈和甲霜靈在0.2～5.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

圖3 多菌靈和甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖Fig.3 Chromatograms of carbendazim and metalaxyl standard solution

以3倍信噪比計算檢出限(LOD)，10倍信噪比計算定量限(LOQ)，結(jié)果如表2所示。

2.3 方法的回收率和精密度

在空白陰性紅葡萄酒中加多菌靈和甲霜靈混標(biāo)進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，加標(biāo)濃度分為低、中、高三個級別，分別為最大殘留量MRL(多菌靈為0.5 mg/L，甲霜靈為1.0 mg/L)的0.5，1.0，3.0倍，即多菌靈加標(biāo)濃度為0.25 mg/L，0.5 mg/L，1.5 mg/L;甲霜靈加標(biāo)濃度為 0.5 mg/L，1.0 mg/L，3.0 mg/L，個濃度做 5次平行實驗評價方法精密度。按照優(yōu)化后的QuECh-ERS方法進(jìn)行樣品前處理，按照1.4所示色譜條件進(jìn)樣，加標(biāo)多菌靈和甲霜靈的樣品色譜圖如圖4。加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD如表3。

表2 多菌靈和甲霜靈的檢出限和定量限Table 2 The limit of detection and the limit of quantitation of carbendazim and metalaxyl

圖4 加標(biāo)多菌靈和甲霜靈的樣品色譜圖Fig.4 Chromatograms of the sample spiked with carbendazim and metalaxyl

表3 多菌靈、甲霜靈的最大殘留限量(MRL)、回收率和RSD值(n=5)Table 3 the MRL，recovery and RSD of carbendazim and metalaxyl(n=5)

從表3可以得出，該方法中多菌靈和甲霜靈的回收率為85.3% ～98.34%，說明方法的準(zhǔn)確度良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為3.61% ～10.22%，符合分析要求。

2.4 實際樣品的檢測

歐盟規(guī)定葡萄酒中多菌靈的最大殘留量(MRL)為0.5 mg/L，甲霜靈的最大殘留量(MRL)為1.0 mg/L。實驗選取國內(nèi)2個品牌3種紅葡萄酒及法國兩個品牌紅葡萄酒，分別按照上述前處理和樣品分析方法進(jìn)行檢測，這5種紅葡萄酒均未檢出多菌靈和甲霜靈殘留，這也說明這些葡萄酒中農(nóng)藥殘留控制較好。該方法的檢出限值和定量限值都低于紅葡萄酒中的限量要求，該方法適合測定紅葡萄酒中的多菌靈、甲霜靈農(nóng)殘。

3 結(jié)論

綜合考慮多菌靈和甲霜靈(分別屬于苯并咪唑類和酰胺類農(nóng)藥)的性質(zhì)，對QuEChERS的提取鹽和凈化試劑進(jìn)行合理的優(yōu)化，最終選用NaCl+NaAc為提取鹽，選用PSA作為凈化劑。QuEChERS方法通用性強、所需提取溶劑少、提取效率高、廉價且操作簡便。通過加標(biāo)回收率實驗，2種農(nóng)藥的回收率為85.3% ～98.34%，說明方法的準(zhǔn)確度良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值3.61% ～10.22%，符合分析要求，適合分析紅葡萄酒中多菌靈和甲霜靈殘留。研究結(jié)果也可為檢測葡萄酒中其他苯并咪唑類和酰胺類農(nóng)藥殘留提供參考方法。

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