朱攀攀，馬亞琴，竇華亭，胡中海，2，汪志濤，韓智

1(西南大學(xué) 柑橘研究所，重慶，400712)2(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

血橙屬于臍橙類，具有色澤、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)等均俱佳的特點(diǎn)，既適鮮食，又可用于生產(chǎn)加工，深受廣大消費(fèi)者的青睞［1］。食用后的血橙皮占果實(shí)的1/3，常作為廢棄物被丟棄，不僅浪費(fèi)資源，且造成環(huán)境的污染［2］。黃酮類化合物是一類重要的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中蕓香柚皮苷和橙皮苷是血橙中主要的黃酮類物質(zhì)［3］，但血橙皮渣中橙皮苷的含量遠(yuǎn)高于蕓香柚皮苷的，相差幾倍至幾十倍，甚至百倍，這可能與地區(qū)和品種相關(guān)，如批次(20110818013)枳物2種黃酮類化合物相差近20倍［4］。同時(shí)它們具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病［5］、抗衰老、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，還具有防癌抗癌療效［6-7］。因此，對(duì)血橙皮的開發(fā)利用意義重大，既有利于資源再生又可保護(hù)環(huán)境。

超聲波是一種彈性機(jī)械振動(dòng)波，它能產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)，產(chǎn)生高速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，能破壞植物細(xì)胞，加速溶劑滲透到植物細(xì)胞內(nèi)，促使液-固之間發(fā)生分子的相互滲透，進(jìn)而促進(jìn)有效成分的溶解，加快有效成分進(jìn)入介質(zhì)［8-10］。目前黃酮類化合物的提取方法主要有堿性稀醇或堿性水、有機(jī)溶劑、超濾、超聲波、微波和酶法等［11］。已有研究表明，超聲波提取法具有提取時(shí)間短、效率高、低溫等優(yōu)點(diǎn)［12］，近年來(lái)已廣泛用于黃酮類化合物及其他天然活性成分的提取，如紅棗核、銀杏葉、山楂、艾葉等總黃酮的提取及多糖的提取等。郝云彬等［13］利用超聲波技術(shù)在橘皮中提取了橙皮苷，認(rèn)為甲醇作為提取溶劑更有利于橙皮苷的溶出;Ma等［14］研究了超聲波輔助提取對(duì)椪柑皮中橙皮苷含量的影響，結(jié)果表明提取溶劑、超聲頻率和提取溫度對(duì)橙皮苷提取率均產(chǎn)生顯著性影響;隨后黃運(yùn)紅等［15］也利用超聲波提取了臍橙皮中的黃酮類化合物，得出了超聲波提取具有工藝簡(jiǎn)單，操作方便且對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn);王華等［16］運(yùn)用超聲波輔助乙醇提取了柑橘皮渣發(fā)酵液的總黃酮，得出料液比和超聲時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)總黃酮提取率影響顯著，其他均不顯著;張玉等［17］利用響應(yīng)面法優(yōu)化柑橘皮渣中類黃酮的超聲波提取工藝研究，發(fā)現(xiàn)采用新鮮柑橘皮渣更有利于類黃酮的提取;劉蓉等［18］應(yīng)用超聲波法對(duì)塔羅科血橙皮中黃酮類化合物進(jìn)行了相關(guān)研究，他們?cè)趩我蛩氐幕A(chǔ)上利用正交試驗(yàn)得到了最佳提取工藝:1∶35(g∶mL)的料液比、提取溫度50℃、溶劑的體積分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間40 min，超聲波功率400 W時(shí)提取率可達(dá)1.021 3%，各因子對(duì)黃酮類化合物提取率影響的主次順序遞減的。但就血橙皮渣中主要的黃酮類物質(zhì)蕓香柚皮苷和橙皮苷的同時(shí)提取鮮有報(bào)道。

本研究采用超聲波輔助提取血橙皮渣中的蕓香柚皮苷和橙皮苷，進(jìn)而有效提取血橙皮渣中黃酮類化合物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料與試劑

血橙皮渣，西南大學(xué)柑桔研究所中試車間榨汁所得，50℃烘干。粉碎過(guò)篩得到粒徑為80目的樣品，置于玻璃干燥皿上備用;

甲醇，冰乙酸，均為分析純，均購(gòu)自于成都市科龍化工試劑廠;蕓香柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為≧95.5%，均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備

超聲波清洗器 DP-800，上海生析超聲儀器有限公司;電子分析天平 FAZ004B，上海精密儀器有限公司;高效液相色譜儀 ultimate3000，戴安中國(guó)有限公司;氮吹儀TTL-DCI，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃酮含量的測(cè)定

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用高效液相色譜測(cè)定蕓香柚皮苷和橙皮苷的含量。檢測(cè)條件［19］:色譜柱為Thermo Fisher色譜柱(5 μm，100 A，4.6 mm ×250 mm，柱溫 30 ℃，V(1%冰乙酸)∶V(甲醇)=60∶40，流速1.000 mL/min，進(jìn)樣量20.000 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別準(zhǔn)確稱取0.005 g和0.018 0 g的蕓香柚皮苷和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，體積分?jǐn)?shù)(下同)80%甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中作為母液，將以上母液分別稀釋成不同的稀釋度，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 蕓香柚皮苷和橙皮苷的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equations and correlation coefficients of narirutin and hesperidin

1.3.1.2 黃酮含量的測(cè)定

樣品制備:取經(jīng)前處理的血橙皮渣粉末，按料液比1∶40(g∶mL)加入80%的甲醇，超聲功率的60%即480 W提取40 min后，精確取1 mL提取液置于氮吹儀蒸發(fā)濃縮至干并用1 mL 50%的甲醇溶解，備用，按以上檢測(cè)條件定量測(cè)量。采用外標(biāo)法定量計(jì)算蕓香柚皮苷和橙皮苷的含量。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取1 g的血橙皮渣粉末，80%甲醇為提取溶劑，分別考察了料液比、超聲波提取時(shí)間、超聲波提取溫度、超聲波功率對(duì)黃酮含量的影響。(1)料液比。選擇 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL);(2)超聲波提取時(shí)間。分別在20、30、40、50、60 min 處理;(3)超聲波提取溫度。分別為31、40、50、60℃提取血橙皮渣中的兩種黃酮類物質(zhì);(4)超聲波功率。在25 kHz和60 kHz的頻率下，分別以 160、320、480、640、800 W的超聲功率為單因素，超聲處理后，處理液過(guò)濾，濾液備用待測(cè)。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以excel和origin9分析軟件結(jié)合進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 料液比對(duì)血橙皮渣中黃酮類物質(zhì)含量的影響

本研究的料液比指血橙皮渣粉末的質(zhì)量與提取溶劑甲醇體積之比(g∶mL)。由圖1可知。蕓香柚皮苷和橙皮苷隨料液比的變化其含量變化規(guī)律相似，但有所差異。蕓香柚皮苷在1∶40時(shí)含量最高，而橙皮苷的含量呈現(xiàn)出繼續(xù)增加的趨勢(shì)，這可能由于蕓香柚皮苷和橙皮苷對(duì)提取溶劑的極性本身存在差別［14］，橙皮苷與80%的甲醇極性更為相當(dāng)，隨提取溶劑體積的增加橙皮苷更有利于溶出，所以其含量持續(xù)增加，但增幅變小。此外，料液比增加同樣會(huì)加速物料中的其他成分溶解，進(jìn)而影響蕓香柚皮苷和橙皮苷的提取量。比較2種黃酮含量的變化，考慮到提取效果和經(jīng)濟(jì)效益，選擇1∶40的料液比較為合適。這與Yang等［20］利用超聲波從四棱樹中提取蘆丁和槲皮素的研究中得出了相似的結(jié)論。

圖1 料液比對(duì)血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with 480 W for 40 min at 50℃

2.2 提取時(shí)間對(duì)血橙皮渣中黃酮類物質(zhì)含量的影響

超聲波處理時(shí)間對(duì)血橙皮渣中黃酮類化合物的影響如圖2所示。由圖2可知，2種黃酮類物質(zhì)隨著提取時(shí)間的增加有相似的變化規(guī)律。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，2種黃酮物質(zhì)含量先增加后減小，50 min后出現(xiàn)1個(gè)突變。40 min之前，2種黃酮含量迅速增加，30～40 min時(shí)增幅變小。主要原因在于處理時(shí)間較短時(shí)細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)的濃度差比較大，存在較明顯的濃度梯度，為黃酮類物質(zhì)的溶出提供一定動(dòng)力，同時(shí)在超聲波的作用下，兩類黃酮化合物能快速?gòu)募?xì)胞溶出。但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，由于超聲波產(chǎn)生的大量熱和空化效應(yīng)，可能對(duì)2種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)有所破壞［19，21］，導(dǎo)致黃酮含量下降。在 50 ～60 min 又呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)，這可能由于隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和周圍環(huán)境溫度的提高，2種黃酮類物質(zhì)被提取的同時(shí)，又被溶劑溶解而發(fā)生了降解反應(yīng)［21］使黃酮含量增幅變緩。綜合比較2種黃酮物質(zhì)的變化趨勢(shì)可知，提取時(shí)間為40 min時(shí)較為合適，張玉等［17］在利用響應(yīng)面法優(yōu)化柑橘皮渣中類黃酮的超聲波提取工藝研究中得到相同的結(jié)果。

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with 480 W at 50℃

2.3 提取溫度對(duì)血橙皮渣中黃酮類物質(zhì)含量的影響

提取溫度對(duì)血橙皮渣中黃酮類物質(zhì)的影響如圖3所示。

圖3 不同提取溫度對(duì)血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with 480 W for 40 min

由圖3可知，隨溫度的升高，2種黃酮的含量先增大后降低，且橙皮苷對(duì)溫度的變化趨勢(shì)更為明顯。提取溫度從30℃升高到50℃，黃酮含量迅速升高，主要在于溫度升高能加快體系分子的運(yùn)動(dòng)速度，有利于黃酮類化合物向溶劑中擴(kuò)散。當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，兩類黃酮含量略有下降，因?yàn)闇囟冗^(guò)高時(shí)提取出的黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)被破壞，從而使兩類黃酮含量降低［22-23］。綜合經(jīng)濟(jì)效益、黃酮產(chǎn)率等因素，50℃的提取溫度對(duì)血橙皮渣中2種黃酮類化合物的提取效果較好。

2.4 超聲功率對(duì)血橙皮渣中黃酮類物質(zhì)含量的影響

超聲技術(shù)近年來(lái)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，根據(jù)其能量強(qiáng)度可分為兩大類［24-25］:高頻低能超聲和低頻高能超聲。高頻低能超聲指能量低于1 W/cm2而頻率高于100 kHz的超聲波，主要用于無(wú)損檢測(cè)和食品材料中物理化學(xué)特性的診斷，獲得食品組成、質(zhì)構(gòu)、流變學(xué)性質(zhì)等。低頻高能超聲則指能量高于1 W/cm2而頻率低于100 kHz的超聲波，能產(chǎn)生較大的空穴效應(yīng)，機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)。本研究所采用的超聲波為定制的低頻高能超聲波，基于前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［14］，即超聲頻率低于100 kHz時(shí)提取效果更理想，此外，考慮到單臺(tái)超聲波設(shè)置多個(gè)超聲頻率可能影響實(shí)際提取效率，設(shè)定的超聲頻率分別為25 kHz和60 kHz。

2.4.1 25 kHz超聲條件下超聲功率對(duì)黃酮類化合物的影響

圖4 25 kHz條件下超聲功率對(duì)血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with frequency of 25 kHz for 40 min at 50℃

由圖4可知，2種化合物的含量變化在試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著超聲波功率的增大而升高，這主要因?yàn)楣β实脑龃笫钩暡ū憩F(xiàn)出的機(jī)械效應(yīng)，空化效應(yīng)都顯著增加，加快了黃酮化合物的溶出。當(dāng)超聲波功率由160 W升高至320 W，2種黃酮化合物的含量的增加幅度較大。由320 W至800 W，其含量增加的幅度較小。原因可能由于超聲功率越大轉(zhuǎn)化為熱損耗的和散射的能量越多，從而進(jìn)入組織內(nèi)部的能量相對(duì)減少［14］。同時(shí)，為提高黃酮的溶出，后續(xù)試驗(yàn)采用480 W的超聲波功率提取血橙中的黃酮類化合物。劉蓉等［18］利用超聲波提取了塔羅科血橙皮中黃酮類化合物，研究結(jié)果同樣認(rèn)為480 W的超聲功率較為合適。

2.4.2 60 kHz超聲條件下超聲功率對(duì)黃酮化合物的影響

選擇60 kHz的超聲頻率，所得血橙皮渣中黃酮類化合物的含量如圖5所示。

圖5 60 kHz條件下不同提取功率對(duì)血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on yields of narirutin and hesperidin from blood orange peels using 80%methanol with frequency of 60 kHz for 40 min at 50℃

由圖5可知，60 kHz超聲頻率下，超聲處理得到2種黃酮類化合物的變化趨勢(shì)與25 kHz超聲頻率下(圖4)得到的基本相同。但不同之處在于蕓香柚皮苷在480 W時(shí)，其黃酮含量沒(méi)有增加反而略微下降。此外，25 kHz的超聲頻率下處理得到的2種黃酮類物質(zhì)的含量整體高于60 kHz的。表明在本研究條件下，25 kHz的超聲頻率更有利于黃酮類物質(zhì)的提取。Lorimer等［26］研究報(bào)道了隨著超聲頻率的增加空穴氣泡反而減小，表明低頻高能超聲(16～100 kHz)產(chǎn)生了較大的空穴強(qiáng)度，并隨著頻率的增加空穴強(qiáng)度逐漸減弱。另外，超聲功率在超聲波提取過(guò)程中是非常重要的一個(gè)參數(shù)，前期的研究表明［27］，超聲功率隨著超聲波傳播距離的增加而發(fā)生衰減從而引起提取率的降低，以及各超聲參數(shù)之間的互作效應(yīng)對(duì)提取結(jié)果可能產(chǎn)生影響，這方面正在開展進(jìn)一步的研究。同樣考慮到黃酮含量的高低、經(jīng)濟(jì)效益等因素，后續(xù)試驗(yàn)仍采用480 W的超聲波功率提取血橙中的黃酮類化合物。

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)得出以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇為提取溶劑的條件下，超聲波輔助提取血橙皮渣中的蕓香柚皮苷和橙皮苷的最佳工藝為:物料比1∶40(g∶mL)，超聲波處理時(shí)間40 min、提取溫度50℃、超聲波功率為480 W，超聲頻率為25 kHz。

(2)與超聲波輔助提取血橙皮渣中總黃酮的最佳工藝［17］比較，在選擇提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)存在較大差別，本文采用體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇對(duì)橙皮苷和蕓香柚皮苷的進(jìn)行了提取，而總黃酮的提取采用的是體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇為提取溶劑;此外，超聲因素料液比對(duì)黃酮類物質(zhì)影響的程度也存在差異。

(3)通過(guò)本研究得到超聲波提取溫度和時(shí)間對(duì)血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷含量的影響最為顯著，血橙皮渣中本身橙皮苷和蕓香柚皮苷的含量差異較大［4，28］，同時(shí)為在同一條件下比較研究，故選用了相同的提取條件。25 kHz超聲頻率下處理比60 kHz超聲頻率更有利于黃酮類物質(zhì)的提取。超聲參數(shù)主要通過(guò)增強(qiáng)或減弱超聲波的空化效應(yīng)對(duì)蕓香柚皮苷和橙皮苷的提取量產(chǎn)生影響，其次，熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)也可能產(chǎn)生一定的輔助作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)各超聲參數(shù)對(duì)血橙皮渣中2種黃酮類物質(zhì)提取量的影響都較為顯著，表明超聲波應(yīng)用于提取柑橘皮渣中的黃酮具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于各超聲參數(shù)間可能存在的協(xié)同交互作用，這方面的研究有待于進(jìn)一步深入開展。

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